p53和TAZ在三陰性乳腺癌中的表達和意義

祝景偉，孟 超，佟經偉，許培權

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptors,ER)、孕激素受體(progesterone receptors,PR)和人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均為陰性的乳腺癌。TNBC惡性程度高、侵襲性強、易遠處轉移、預后差、對內分泌及靶向治療反應不敏感，目前尚缺乏有效的治療方案。因此，尋找有效的靶向治療分子，對TNBC的早期診斷及治療至關重要。p53是與腫瘤高度相關的抑癌基因，在乳腺癌的發生發展過程中起著重要的作用。轉錄共激活因子PDZ結合基序(transcriptional co-activator with PDZ binding motif,TAZ)是Hippo信號通路下游主要的效應分子之一，具有調控細胞增殖、分化、侵襲轉移的作用。TAZ作為重要的致癌基因在多種人類腫瘤中存在高表達。本文以此為出發點，通過免疫組織化學方法檢測p53和TAZ在TNBC組織中的表達，探討p53、TAZ與TNBC病人的臨床病理特征的關系，為TNBC的靶向治療提供依據。現作報道。

1 一般與方法

1.1 臨床資料 收集2013年11月至2014年12月我科收治的TNBC病人30例，取同期非三陰性乳腺癌(non-triplenegative breast cancer,non-TNBC)病人30例作對照組。所有病人均為女性，年齡28～72歲；腫瘤大小≤2 cm 30例，>2～5 cm 26例，>5 cm 4例；無淋巴結轉移28例，有淋巴結轉移32例；TNM分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例；組織學分級：Ⅰ～Ⅱ級38例，Ⅲ級22例。所有病人術前均未接受過放療、化療、靶向及內分泌治療，入院后經我院病理科確診為浸潤性乳腺癌后行乳腺癌改良根治術。TNBC組和non-TNBC組比較，年齡、TNM分期和組織學分級差異無統計學意義(P>0.05)，TNBC組腫瘤大小>2 cm、淋巴結轉移率均大于non-TNBC組(P<0.05和P<0.01)(見表1)。

表1 TNBC和non-TNBC組臨床資料比較

1.2 p53和TAZ檢測方法 p53抗體購自福州邁新生物技術開發有限公司，兔抗人TAZ抗體購自美國Abcam公司(ab110239)。所有標本均經10%甲醛溶液固定，采用免疫組織化學標記(S-P法)進行檢測。石蠟標本常規切片后脫蠟、水化，蒸餾水沖洗，用PBS(pH=7.4)沖洗3次，每次3 min。高溫高壓對組織抗原進行修復，冷卻至室溫，PBS緩沖液浸泡5 min，重復3次。3%過氧化氫室溫下孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加第一抗體(p53抗體/TAZ抗體)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min，甩去PBS，滴加二抗(根據福州邁新生物技術開發有限公司和Abcam公司二抗試劑盒說明書進行操作)，PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加DAB顯色液，蒸餾水沖洗，進行復染，脫水，透明，自然干燥后封片。

1.3 結果判斷標準 本實驗中的病理檢測結果的判斷由我院病理科2名高年資副主任醫師擔任。p53的陽性染色結果為細胞核中出現棕黃色顆粒；TAZ蛋白表達在細胞核和/或細胞質中，并呈棕黃色顆粒為陽性。隨機選取5個高倍鏡(200倍)視野，根據細胞著色比例和染色強度進行評價。細胞著色比例：<10%記為0分，10%～25%記為1分，>25%～50%記為2分，>50%～75%記為3分，>75%記為4分；染色強度：無著色記為0分，淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分。上述兩項結果相乘，得分<3為陰性，≥3為陽性。

1.4 統計學方法 采用χ2檢驗和Spearman秩相關分析。

2 結果

2.1 p53在TNBC組織和non-TNBC組織中的表達 p53在TNBC和non-TNBC組織中均有表達(見圖1～4)。2組陽性率差異無統計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 p53在TNBC和non-TNBC組織中的表達

2.2 TAZ在TNBC組織和non-TNBC組織中的表達 TAZ蛋白在TNBC和non-TNBC組織中均有表達(見圖5～8)。TNBC組織中TAZ陽性率高于non-TNBC(P<0.01)(見表3)。

表3 TAZ在TNBC和non-TNBC組織中的表達

2.3 p53和TAZ在TNBC組織中的表達與臨床病理因素之間的關系 p53的陽性表達與年齡和腫瘤大小有關，年齡≤45歲、腫瘤>2 cm的p53的陽性表達率較高(P<0.05)，而與臨床病理分期、組織學分級、淋巴及轉移情況無關(P>0.05)。TAZ的陽性表達與腫瘤大小和組織學分級有關，腫瘤>2 cm、組織學分級Ⅰ～Ⅱ的陽性表達率較高(P<0.01和P<0.05)，而與發病年齡、臨床病理分期、淋巴及轉移情況無關(P>0.05)(見表4)。

表4 TNBC中TAZ和YAP的表達與臨床病理參數的關系

2.4 p53和TAZ在TNBC組織中表達的相關性 在TNBC中，p53和TAZ共同陽性表達的有14例，共同陰性表達的有7例。根據Spearman相關分析結果顯示，p53和TAZ蛋白在TNBC中的表達呈正相關(rs=0.381,P<0.05)。

3 討論

乳腺癌是一種高度異質性的惡性腫瘤，根據癌組織基因表達譜的差異將乳腺癌分為5個亞型[1-2]，分別是：管腔A型、管腔B型、正常乳腺樣型、HER-2過表達型和Basal-like型，而后兩個亞型的惡性程度更高、預后更差[3]。臨床工作中，由于基因檢測技術較復雜、成本較高很少開展，而常應用免疫組織化學染色方法，結合ER、PR及Her-2的狀態進行乳腺癌的分型。TNBC是應用免疫組織化學方法鑒定出來的一個亞型。但研究[4]發現，85%的TNBC是Basal-like型乳腺癌。TNBC占所有乳腺癌的15%～20%[5]。與其他乳腺癌亞型相比，TNBC的發病年齡較輕、腫瘤直徑大、組織學分級高、腋窩淋巴結常陰性、易復發和遠處轉移、生存時間短等[6-7]。本組資料顯示，發病年齡最輕(28歲)的發生在TNBC組，且年齡≤45歲的病人多于non-TNBC組；腫瘤直徑常>2 cm、淋巴結轉移率不高(P<0.05)，與以上報道基本一致。

Hippo信號通路是近年來首先在果蠅中發現的一條高度保守的抑制性信號通路，通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡來調節器官的發育[8]。越來越多的研究[9-13]表明，該信號通路的異常與多種腫瘤的發生有關。TAZ是Hippo信號通路的核心下游轉錄調控因子之一，在多種腫瘤中存在過表達現象[9-10，14]。本文研究結果顯示：TAZ在TNBC組織中的陽性表達率為56.7%，高于non-TNBC組織(16.7%)；TAZ在腫瘤直徑>2 cm的TNBC組織中表達較高；TNBC組的組織學分級以Ⅱ、Ⅲ級為主(29/30)，TAZ在分化較差的組織中陽性表達率高。腫瘤大小、組織學分級是公認的乳腺癌預后因素，TAZ的表達與其相關，提示TAZ可能與TNBC的惡性程度高、預后差的特征有一定的相關性。

p53基因是位于人17號染色體短臂上的腫瘤相關基因，分為野生型和突變型。野生型p53屬于抑癌基因，可抑制腫瘤的發生；而突變型p53喪失了抑制腫瘤發生發展的功能，具有促進腫瘤形成的作用。p53基因與50%以上的人類腫瘤有關[15]，而在TNBC中p53的突變率高達80%[16]，且p53的表達與乳腺癌的預后相關。本研究顯示，p53在TNBC和non-TNBC組織中的表達無明顯差異；但p53的陽性表達與TNBC腫瘤大小相關，與TNBC病人的年齡、淋巴結轉移、TNM分期及組織學分級無相關性。可能是由于樣本量太少，研究結論尚需進一步大樣本研究驗證。

綜上所述，TAZ高表達于TNBC組織中，且與TNBC病人的腫瘤大小、組織學分級相關；雖然p53在TNBC和nonTNBC組織中的表達無明顯差異，但是p53與TNBC病人腫瘤大小相關，且在TNBC中p53與TAZ的表達呈正相關。因此，TAZ與TNBC的發生發展有關，可能成為TNBC新的治療靶點，p53與TNBC的關系尚需要大樣本進行統計驗證。