羊肚菌多糖飲液的制備

王雪梅 龍葉峰 周樂松 伍泳達 范 瑞 周春暉*

（1廣東輕工職業(yè)技術學院食品與生物技術學院，廣東廣州 510030；2廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東廣州 510303）

羊肚菌（Morchella esculenta）又稱羊蘑、羊肚菜、羊肚蘑，其多糖是羊肚菌體內(nèi)主要的活性成分，具有抗病毒、抗腫瘤、抗疲勞、調(diào)節(jié)機體免疫力、降血脂、預防動脈粥樣化等眾多功效。目前，羊肚菌仍以烹飪食用為主，其他加工食品較少，因此，提取羊肚菌的功能活性成分——多糖，并研制出無須烹調(diào)、方便攜帶、食用便利的羊肚菌多糖飲液，有利于提高羊肚菌多糖的利用價值。羊肚菌多糖提取方法主要有水提法、酶解法、超聲波輔助提取法、微波萃取法等。筆者以云南麗江的羊肚菌為原料，采用酶解水提法提取羊肚菌多糖，并采用正交法研制成羊肚菌多糖飲液，為羊肚菌多糖功能食品的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要設備

泛美羊肚菌（中號）：購自云南麗江批發(fā)市場；纖維素酶（酶活性為1×105U/g），和氏璧生物科技有限公司；菠蘿蛋白酶（酶活性為1×105U/g），鑫誠生物科技有限公司；無水乙醇，河南鑫河陽酒精有限公司；葡萄糖：天津市致遠化學試劑有限公司；98%濃硫酸，洛陽市化學試劑有限公司；苯酚，天津市永大化學試劑有限公司。試驗中所用化學試劑均為分析純。

101-3AB型電熱鼓風干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；FW177型中草藥粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；pH-100筆式酸度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；LH-Q90型折光儀，杭州陸恒生物科技有限公司；JJ500A型分析天平，福建艾杰爾進出口有限公司；V-5100型分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取多糖

1.2.1.1 提取流程

取大小相近的羊肚菌子實體剪柄除雜，放置干燥箱中55℃干燥3 h，粉碎，過孔徑0.425 mm網(wǎng)，得到羊肚菌粉末，置干燥器中保存?zhèn)溆肹1]。取5 g羊肚菌粉末，加入150 mL去離子水溶解，加入1%的纖維素酶，調(diào)節(jié)pH為5.0，55℃酶解1 h，然后升溫至80℃水提2 h，升溫至95℃滅活，離心取上清液，加入4倍無水乙醇醇沉18 h，5 000 r/min離心15 min，取沉淀用相同倍數(shù)去離子水溶解，加入1%菠蘿蛋白酶50℃酶解1 h脫蛋白，離心取上清液，即得羊肚菌多糖溶液。

1.2.1.2 多糖含量的檢測

采用硫酸-苯酚法對多糖進行檢測。將羊肚菌多糖溶液定容至50 mL容量瓶，移取2.0 mL至試管中，加入1.0 mL 6%的苯酚溶液、5.0 mL的濃硫酸，搖勻、靜置30 min，490 nm處測定吸光值[2]。

其中，C為羊肚菌多糖的質(zhì)量濃度（mg/mL）；N為試驗中的稀釋倍數(shù)；M為羊肚菌子實體的質(zhì)量（g）；V為多糖溶液稀釋的倍數(shù)；f為換算系數(shù)。

1.2.1.3 多糖提取單因素試驗

以多糖得率為指標，分別選取液料比、酶解酶用量、酶解時間、浸提時間為影響因素，設計單因素試驗，考察各因素對多糖得率的影響（控制其他因素不變），單因素試驗因素設置：液（mL）料（g）比20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1；酶用量0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；酶解時間0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h；浸提時間1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h。

1.2.1.4 響應面優(yōu)化多糖提取工藝

為了有效優(yōu)化羊肚菌多糖的提取工藝，依據(jù)單因素試驗的結果，選取液料比、酶解時間、浸提時間三個影響顯著的因素，以多糖得率為響應值，采用Design-Expert 8.0.5設計響應面優(yōu)化試驗，響應面因素和水平見表1。

1.2.2 羊肚菌多糖飲液制備

取適量的羊肚菌多糖溶液，加入適量的三氯蔗糖、低聚果糖、VC，攪拌均勻，轉移至均質(zhì)機均質(zhì)15 min，裝瓶50 mL，90℃滅菌20 min，冷卻后即可得到成品。

1.2.2.1 飲液評價指標

如表2所示，飲液以感官評價為綜合指標，其中風味30分、口感30分、組織狀態(tài)25分、色澤15分，滿分100分。

表2 羊肚菌多糖飲液感官評價內(nèi)容

1.2.2.2 羊肚菌多糖飲液單因素試驗

選定三氯蔗糖添加量為0.15 g/kg、低聚果糖添加量為40 g/kg、VC添加量為0.4 g/kg，多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，分別考察不同多糖質(zhì)量濃度（1 mg/mL、1.5 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、3 mg/mL）、三氯蔗糖添加量（0.05 g/kg、0.1 g/kg、0.15 g/kg、0.2 g/kg、0.25 g/kg）、低聚果糖添加量（20 g/kg、30 g/kg、40 g/kg、50 g/kg、60 g/kg）、VC添 加 量（0.25 g/kg、0.3 g/kg、0.35 g/kg、0.4 g/kg、0.45 g/kg）對羊肚菌多糖飲液的影響。

1.2.2.3 正交試驗優(yōu)化多糖飲液配方

根據(jù)單因素試驗的結果，選定多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL，選取三氯蔗糖添加量、低聚果糖添加量、VC添加量進行正交試驗，試驗因素和水平如表3。

表3 多糖飲液正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 羊肚菌多糖提取單因素試驗結果

由圖1可得，羊肚菌多糖得率均隨液料比、酶用量、酶解時間、浸提時間的增大（延長）呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。分別在液料比35∶1、酶用量1.20%、酶解時間1.5 h、浸提時間2 h時，多糖得率達最大值，分別為6.46%、5.71%、6.02%、6.32%，隨后開始下降。原因可能是液料比過大，過量提取劑對提取體系內(nèi)的傳熱和傳質(zhì)造成影響而導致多糖得率下降[3]；酶用量過多，過多的酶使已經(jīng)飽和的酶分子與反應底物接觸過度而降低體系的反應速度，使多糖溶出量減少[4]；酶解時間過長，導致少量羊肚菌多糖結構發(fā)生變化[5]，使多糖得率逐漸下降；浸提時間過度延長，細胞內(nèi)外滲透壓趨于平衡，多糖溶出水溶液的推動力逐步下降，同時長時間的高溫會使一部分多糖發(fā)生降解[6]，導致羊肚菌多糖得率下降。

圖1 不同液料比、酶用量、酶解時間、浸提時間對羊肚菌多糖得率的影響

2.2 響應面優(yōu)化提取工藝試驗結果

根據(jù)單因素試驗的結果，固定酶用量為1.2%，以液（mL）料（g）比（A）、酶解時間（B）、浸提時間（C）為顯著因素，響應面優(yōu)化結果如表4。

表4 提取多糖響應面優(yōu)化結果

對表4試驗結果進行多元回歸擬合，所得回歸方程為Y=7.23+0.011A+0.080B+0.069C+1.000E-002AB+0.073AC-0.10BC-0.25A2-0.29B2-0.26C2，回歸模型方差如表5所示。

表5 回歸模型方差表

由表5可得，各因素對多糖得率影響的程度依次為B（酶解時間）＞C（浸提時間）＞A（液料比），回歸模型的F為9.29，P＜0.01，極顯著，失擬項的F為16.60，P＜0.05，失擬項不顯著，該模型擬合度較好，且科學、可用。

由圖2的響應面圖和等高線圖可得，各因素中每兩兩因素之間交互作用顯著，在液料比32∶1~38∶1、酶解時間1.2~1.8 h時；液料比32∶1~38∶1、浸提時間1.7~2.3 h時；酶解時間1.2~1.8 h、浸提時間1.7~2.3 h時，多糖得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。經(jīng)過對模型的分析，得到最佳配方：液料比35.21∶1，酶解時間1.56 h，浸提時間2.06 h，該條件多糖得率為7.24%，為方便操作，將提取工藝修改為液料比35∶1，酶解時間1.5 h，浸提時間2 h，經(jīng)驗證羊肚菌多糖得率為7.21%，優(yōu)化效果明顯。

2.3 羊肚菌飲液單因素試驗結果

由圖3可得，羊肚菌多糖飲液的得分均隨多糖質(zhì)量濃度、三氯蔗糖添加量、低聚果糖添加量、VC添加量的上升呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。當多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL、三氯蔗糖添加量為0.15 g/kg、低聚果糖添加量為40 g/kg、VC添加量為0.4 g/kg時，羊肚菌飲液的得分均達最高，隨后開始下降。其原因是羊肚菌多糖本身具有獨特的風味，其添加量過多或過少均會影響飲液口感，三氯蔗糖、低聚果糖有甜味，VC有酸味，甜味過多或者酸味過多均會影響飲液的口感。

圖2 響應面圖和等高線圖

圖3 羊肚菌多糖質(zhì)量濃度，三氯蔗糖、低聚果糖、VC添加量對飲液綜合得分的影響

2.4 羊肚菌多糖飲液正交試驗結果

由表6可知，三個因素對羊肚菌多糖飲液結果影響的程度為A＞C＞B，即三氯蔗糖的添加量＞VC的添加量＞低聚果糖的添加量，三氯蔗糖添加量對飲液配方的影響最大，低聚果糖添加量對飲液配方的影響最小，最優(yōu)組合為A2B2C2，即三氯蔗糖的添加量為0.15 g/kg，低聚果糖的添加量為40 g/kg，VC的添加量為0.4 g/kg。

表6 羊肚菌多糖飲液正交試驗結果

3 小結

酶解水提法提取羊肚菌多糖，并利用其研制羊肚菌多糖飲液。設置單因素試驗，通過方差分析排除對多糖得率影響較小的因素，并對其他影響因素進行響應面優(yōu)化試驗，最終得到提取羊肚菌多糖最佳工藝。選定羊肚菌多糖濃度為2 mg/mL，對其他因素正交試驗研制多糖飲液，直觀分析得到羊肚菌飲液最佳的配方為多糖2 mg/mL，三氯蔗糖0.15 g/kg，低聚果糖40 g/kg、VC 0.4 g/kg。低聚果糖不易引起齲齒，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解便秘、降血脂等功效，目標人群廣泛。

羊肚菌是世界公認的珍稀食用菌之一，提取羊肚菌多糖并加工成功能食品，豐富羊肚菌高附加值產(chǎn)品。試驗也為羊肚菌功能食品的研制提供了參考。