人工栽培桑黃不同生長(zhǎng)期子實(shí)體的主要活性成分測(cè)定比較

張文雋 吳亞召 雷 萍* 馬婧嘉 賈 靜 張 歡

（1陜西省微生物研究所，陜西西安 710043；2陜西崇德生物技術(shù)發(fā)展有限公司，陜西西安 710201）

桑黃（Sanghuangporusspp.）隸屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）非褶菌目（Polyporales）銹革孔菌科（Hymenochaetaceae）桑黃孔菌屬（Sanghuangporus），是多年生大型藥用真菌，因其通常生長(zhǎng)于桑屬植物上，子實(shí)體為黃褐色而得名[1]。《本草綱目》詳細(xì)記載了桑黃的藥性：“味甘、性平。主治女子漏下赤白，血病腹內(nèi)凝塊，腫痛，陰陽(yáng)寒熱，不孕。療月經(jīng)不調(diào)。”[2]民間用于治療肝腹水、肝硬化等癥。現(xiàn)代研究表明，桑黃有效活性成分有多糖類、黃酮類、三萜類、甾類、多酚類、吡喃類及生物堿等，具有顯著的醫(yī)療保健功效及較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[3]。桑黃多糖類物質(zhì)是桑黃主要有效成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、抗炎、護(hù)肝、降血糖血脂等廣泛的藥理作用[4]。黃酮類化合物是桑黃具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、增強(qiáng)心血管系統(tǒng)等作用的重要藥理成分[5]。桑黃含有的三萜類化合物具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等藥用功效[6-10]。不同生長(zhǎng)發(fā)育期的藥用真菌子實(shí)體活性有效成分含量差異較大[11-13]。故藥用菌采收時(shí)間直接影響其有效成分及藥效。研究藥用菌生長(zhǎng)期有效成分含量變化，對(duì)探索其適宜的采收期尤為重要。目前關(guān)于桑黃多糖、總黃酮和總?cè)频难芯繄?bào)道主要集中在提取測(cè)定、分離純化和藥理藥效等方面，對(duì)不同生長(zhǎng)期桑黃子實(shí)體中三種活性成分含量變化研究報(bào)道較少，為此筆者進(jìn)行人工栽培桑黃不同生長(zhǎng)期子實(shí)體的（以下稱桑黃子實(shí)體）多糖、總黃酮、三萜測(cè)定，以期為桑黃子實(shí)體的適時(shí)采收及質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

桑黃桑-S子實(shí)體為2019年6月中旬至8月下旬采集自陜西省微生物研究所試驗(yàn)基地，分別為原基發(fā)生后生長(zhǎng)30 d、40 d、50 d、60 d、70 d、80 d、90 d、100 d。采收后桑黃子實(shí)體由鼓風(fēng)干燥箱68℃烘干2.5 h，粉碎后過(guò)孔徑為0.85 mm篩，備用。

試劑：葡萄糖、蘆丁、齊墩果酸（均為標(biāo)準(zhǔn)品），美國(guó)Sigma；無(wú)水乙醇、苯酚、硫酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯仿、香草醛、冰乙酸、高氯酸（均為分析純）。儀器：WGL-65B鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司），F(xiàn)W177型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市英峪予華儀器廠），TG16高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)（北京松源華興有限公司），TU-1901型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.2 多糖測(cè)定方法

1.2.1 樣品制備

分別精確稱取待測(cè)桑黃樣品2.0 g，加入蒸餾水100 mL充分混勻，70℃水浴提取2 h，真空抽濾，收集濾渣按上述操作重復(fù)1次，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積1/5，加入無(wú)水乙醇至乙醇終濃度達(dá)80%，置于4℃冰箱靜置過(guò)夜，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心15 min，用80%乙醇洗滌沉淀，離心，此操作重復(fù)2次，沉淀用蒸餾水溶解定容至250 mL，即得多糖測(cè)定供試液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取105℃條件下干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖對(duì)照品20 mg，于100 mL容量瓶中溶解定容，配制成0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL于25 mL具塞試管，加入蒸餾水至1 mL。然后加入5%苯酚溶液2 mL，振蕩搖勻，再加入濃硫酸7 mL，充分搖勻，靜置顯色30 min，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 供試液多糖含量的測(cè)定

吸取供試液0.5 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，測(cè)定吸光值并計(jì)算不同生長(zhǎng)期桑黃樣品中多糖含量。

1.3 總黃酮測(cè)定方法[14]

1.3.1 樣品制備

精確稱取待測(cè)桑黃樣品粉末10.0 g，加入70%乙醇200 mL，于室溫下浸提24 h，真空抽濾，收集濾渣按上述操作重復(fù)1次，合并濾液，真空濃縮回收乙醇，濃縮液中加水繼續(xù)濃縮以揮發(fā)殘留的乙醇，水液冷凍干燥，得桑黃提取物。準(zhǔn)確稱取桑黃提取物17.3 mg于25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得總黃酮測(cè)定供試液。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取蘆丁對(duì)照品23.2 mg，于50 mL容量瓶中用70%乙醇溶解定容，配制成0.464 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL于25 mL容量瓶，加入5%NaNO2溶液1 mL，充分搖勻后放置6 min，然后加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，振蕩搖勻放置6 min，再加入4%NaOH溶液10 mL，搖勻后用70%乙醇定容，靜置顯色10 min，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值，計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 供試液總黃酮含量的測(cè)定

吸取供試液3 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，測(cè)定吸光值并計(jì)算不同生長(zhǎng)期桑黃樣品中總黃酮含量。

1.4 總?cè)坪繙y(cè)定方法

1.4.1 樣品制備

準(zhǔn)確稱取待測(cè)桑黃樣品粉末0.2 g，置于100 mL具塞磨口三角瓶，加入氯仿50 mL，超聲處理60 min，放冷，移至100 mL容量瓶中，用氯仿洗滌三角瓶3次，洗滌液合并入同一容量瓶中，并加入氯仿定容至100 mL，搖勻，即得總?cè)茰y(cè)定供試液[15-16]。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精確稱取95℃干燥2 h齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，于100 mL容量瓶中用氯仿溶解定容，配制成0.1 mg/mL的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL于5 mL具塞試管中，常壓下60℃水浴蒸干溶劑。依次加入新配制的5%香草醛-冰乙酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴加熱15 min，取出，立即冰浴冷卻5 min，再水浴調(diào)至室溫。用冰乙酸定容至5 mL，搖勻后于30 min內(nèi)在548 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 供試液總?cè)坪康臏y(cè)定

吸取供試液1 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法操作，測(cè)定吸光值并計(jì)算樣品中總?cè)坪俊?/p>

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2013和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程與相關(guān)系數(shù)

分別繪制多糖、總黃酮和總?cè)茰y(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，相關(guān)系數(shù)均為0.99以上，符合檢測(cè)的要求。

2.2 不同生長(zhǎng)期桑黃子實(shí)體的多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)

不同生長(zhǎng)時(shí)期桑黃子實(shí)體的多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)及變化見(jiàn)表2、圖1、圖2。

表2 不同生長(zhǎng)期桑黃子實(shí)體多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1 不同生長(zhǎng)期桑黃子實(shí)體的多糖、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)

圖2 不同生長(zhǎng)期桑黃子實(shí)體的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)

由表2、圖1和圖2可以看出，多糖、總黃酮、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)時(shí)間的遞增逐漸升高，分別在生長(zhǎng)60 d、70 d時(shí)達(dá)最高，隨后又逐漸下降。

多糖、總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)一致，在子實(shí)體生長(zhǎng)30~70 d逐漸上升，70 d時(shí)達(dá)最大值，為4.26%、2.22%，之后又逐漸降低；總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)在子實(shí)體生長(zhǎng)30~60 d快速上升，至60 d時(shí)達(dá)最高值（24.05%），生長(zhǎng)70 d之后下降迅速。

3 小結(jié)

對(duì)桑黃的三種活性成分測(cè)定結(jié)果表明：人工栽培桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)70 d時(shí)，其多糖和總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)最高，為4.26%、2.22%，生長(zhǎng)80 d次之，為3.87%、1.85%；生長(zhǎng)60 d時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)最高，為24.05%，生長(zhǎng)70 d時(shí)總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅次于60 d，為23.34%。綜合考慮這3種主要有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)中的子實(shí)體產(chǎn)量，桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)70 d時(shí)應(yīng)為最佳采收期，此時(shí)采收可有效保障活性成分含量，為市場(chǎng)提供更為優(yōu)質(zhì)的桑黃產(chǎn)品。