慢性糖尿病性腎損傷對AD 小鼠腦內海馬區淀粉樣斑塊的影響

鄭 娜 劉 希

1）鄭州市第三人民醫院，河南 鄭州450099 2）鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州450052

Alzheimer病（Alzheimer’s disease，AD）為最常見的癡呆類型，目前尚無有效的治療手段。該病起病隱匿，以記憶、認知功能進展性下降，伴思維、語言、計劃能力的降低及精神行為異常，最終完全失去生活自理能力為臨床特點［1-3］。腦內淀粉樣蛋白斑塊沉積、神經纖維纏結、神經元及其突觸結構喪失是AD的三大病理特征［4-5］。具有神經毒性的Aβ 蛋白過量產生并在細胞外沉積形成淀粉樣斑塊，是AD獨有的病理特點［6-7］，盡管AD發病原因可能多種多樣，但最終都會導致Aβ淀粉樣斑塊在腦內大量沉積，并引起下游反應，造成神經元不斷凋亡，降低Aβ的水平成為預防和治療AD的有效途徑［8］。

糖尿病性腎病（diabetic nephropathy，DN）是終末期腎病的最常見原因，隨著肥胖及老齡化的不斷進展，DN的發生率逐年提高。傳統上T2DM和AD被視為獨立的兩個疾病，但通過對T2DM 和AD 的廣泛深入研究，發現二者在流行病學關聯和一些常見的病理生理機制的相通之處。AD 患者常伴2 型糖尿病，與普通人群相比，T2DM 病人患AD 的風險增加50%～150%［8］。除典型的三大病理特征以外，中樞神經細胞胰島素抵抗為AD主要病理特點之一，基礎研究還發現胰島素抵抗或胰島素缺失均可促進Aβ蛋白沉積和τ 蛋白磷酸化，因此AD 被主流學界認為是中樞神經系統內的糖尿病（T3 DM或pre-T2DM）［9-11］。目前DM 與AD 的關系已成為臨床和基礎研究的熱點，事實上AD患者合并糖尿病性腎損傷在臨床中很常見，但糖尿病性腎損傷對AD 認知功能的影響無論基礎研究和臨床研究目前均非常缺乏。

為發現糖尿所致慢性腎損傷對AD 的影響并探究其可能潛在的機制，本研究在動物水平探索DN合并AD對認知功能的影響。通過在AD雙轉基因動物模型APP/PS1E9Δ基礎上通過鏈脲佐菌素及單側腎切除構建的慢性糖尿病性腎損傷動模型，發現慢性糖尿病性腎損傷可增加腦內Aβ 蛋白的表達，加重AD小鼠腦內海馬區淀粉樣斑塊的沉積，同時發現DN小鼠腦內活化的小膠質細胞密度增加，推測可能通過增加膠質細胞的不當過度活化導致斑塊沉積。本研究發現糖尿所致慢性腎損傷可加重AD的病理改變，積極治療DN 可減輕AD 合并DN 患者認知功能下降的進展，為臨床治療提供證據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組APP/PS1 dE9 雙轉基因小鼠（背景C57BL/6J）購于北京澄天生物（iBio Logistics），貨號：34832-JAX。所有用于實驗的小鼠均通過PCR法基因檢測確認APP/PS1dE9 雙轉基因。樣本量估計基于前期預實驗結果及樣本量總估算公式，8 只/組，可實現至少80%的檢驗效能（α=0.05，雙側）。小鼠接受處理后死亡的樣本排除在樣本總量內。24只雄性3 月齡APP/PS1 小鼠（體質量25 ～33 g）采用抽簽法隨機平均分為溶劑+假手術組、鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組、單側腎切除+鏈脲佐菌素糖尿病性腎病組。飼養于每天12 h 日照/黑暗轉換的無菌SFP動物房環境內。

1.2 側腎切除+鏈脲佐菌素糖尿病性腎病模型建立及腎功能檢測按照TESCH等［12］關于糖尿病性腎病模型構建的描述，切除小鼠的右側腎臟。2周后經腹腔注射35 mg/（kg·d）體質量鏈脲佐菌素（STZ）連續5 d，在整個實驗過程中，小鼠的血糖一直處于穩定、中度的高血糖狀態。小鼠24 h的蛋白尿4周即顯著性升高，且隨著時間的延續呈進行性升高的趨勢。切除右側腎4 周后對小鼠血糖及腎功能指標進行檢測。各組在接受處理60 d 后進行血糖及腎功能檢測，采用羅氏血糖儀檢測禁食后12 h每天08：00血糖，血漿尿素氮采用比色檢驗試劑盒（Invitrogen?EIABUN）采用酶標儀在450 nm 讀取吸光度，根據標準曲線計算血漿尿素氮水平，血清肌酐采用PRP-X200陽離子交換柱（Hanmilton，Agilent 1100）的高壓液相色譜（HPLC）系統檢測。

1.3 免疫熒光檢測腦內海馬區淀粉樣斑塊小鼠腦組織經冰的PBS 灌注后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，經30%蔗糖溶液梯度脫水后OCT 包埋。Thermo Scientific冰凍切片機沿矢狀面連續切出10 μm厚度的腦片，經PBST 破膜處理，10%驢血清室溫孵育30 min封閉非特異性抗原。與待檢蛋白相應的一抗4 ℃過夜孵育后，AlexaFlour 488 或AlexaFlour 594（Invitrogen，USA）偶聯的二抗4 ℃2 h孵育，細胞核由含有DAPI 的防光猝滅劑染色。β 淀粉斑塊由鼠抗Aβ 單克隆抗體（6E10，Biolegend，USA）檢測，BACE2由羊抗兔FLAG多克隆抗體（Sigma-Aldrich）檢測；二抗采用AlexaFlour 488 偶聯的驢抗鼠抗體和AlexaFlour 594 偶聯的驢抗羊抗體檢測相應的一抗。Nikon i9 熒光顯微鏡對染色后的腦片進行觀察拍照。在海馬區域隨機每隔100 μm取腦片一張用于統計計數，每只小鼠共取5張。在分析各組小鼠β淀粉樣蛋白載量時，定義淀粉樣蛋白直徑＞20 μm的β淀粉斑塊納入統計范圍，采用image J（NIH）軟件對β淀粉樣蛋白載量進行數量分析，計算每視野中β淀粉斑塊面積占視野總面積額的百分比為斑塊載量。

1.4 ELISA 檢測腦內Aβ40和Aβ42根據制造商提供的ELISA 試劑盒說明，使用β-淀粉樣蛋白比色法的ELISA 試劑盒（購于Invitrogen）測量Aβ1-42（貨號KHB3441）和Aβ1-40（貨號KHB3481）的濃度。稱小鼠半腦質量并在10 倍過量的5 mol/L 胍緩沖液（pH 8.0）中勻漿。將勻漿在室溫下輕輕搖動4 h，并通過30 000 g 高速離心10 min。將離心后的上清液以50 倍濃度加純水稀釋，將胍濃度降低至0.1 mol/L，然后再應用于ELISA。在Biotek EPOCH2酶標儀上讀出讀數并繪制出標準曲線，根據標準曲線計算出濃度。

1.5 統計學方法采用Graphpad Prism 6統計軟件對所有數據進行統計分析。所有結果均以均數±標準差（±s）表示。不同組別不同樣本比較采用one-way ANOVA，采用Kruskal-Wallis非參數檢驗，事后分析采用Dunn’s多重比較檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組小鼠的空腹血糖、血尿素氮、血肌酐水平對各組在接受處理60 d 后進行血糖及血尿素氮、血肌酐等腎功能指標檢測。見表1。

2.2 糖尿病腎損傷加重AD小鼠腦內海馬區淀粉樣斑塊沉積淀粉樣斑塊在海馬區域沉積是引起AD記憶障礙的主要原因。為驗證糖尿所致慢性腎損傷是否對AD 動物腦內斑塊的作用，選擇Aβ 特異的單克隆抗體6E10 對接受不同處理的小鼠腦冰凍切片進行免疫熒光染色。較傳統的蘇丹紅和Thioflavin-S染色，6E10 單克隆抗體對淀粉樣斑塊有較高的敏感性和特異性，使非特異性染色大大降低（圖1A）。結果顯示接受單側腎切除+鏈脲佐菌素糖尿病性腎病組的APP/PS1 小鼠海馬區域β 淀粉樣板塊數量顯著低于接受溶劑+假手術組、鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組（P＜0.05），而接受溶劑+假手術組和鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組差異無統計學意義（P＞0.05，圖1B）。

2.3 糖尿病腎損傷增加AD小鼠腦內Aβ40和Aβ42的表達AD 小鼠腦內Aβ40、Aβ42為淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）剪切后的產物，Aβ 的量可反映出APP 經β剪切的產物的情況。其中Aβ42為最具有細胞毒性的剪切產物，因此，腦內Aβ蛋白的量可發映AD腦內損傷的嚴重程度。結果顯示，單側腎切除+鏈脲佐菌素糖尿病性腎病組AD 小鼠腦內Aβ40、Aβ42蛋白含量均顯著高于溶劑+假手術組、鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組（P＜0.01），而接受溶劑+假手術組和鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組差異無統計學意義（P＞0.05，圖2）。

2.4 糖尿病腎損傷促進AD 小鼠腦內小膠質細胞活化AD 腦內的膠質細胞活化狀況與腦內淀粉樣斑塊的吞噬作用存在相關性，其中小膠質細胞過度反應是AD 嚴重程度的一個重要指標。采用面熒光法對接受不同處理的AD 小鼠腦內海馬區域的Iba-1+的小膠質細胞進行計數，結果發現單位面積內單側腎切除+鏈脲佐菌素糖尿病性腎病組AD小鼠海馬區域內的Iba-1+細胞數量均顯著高于溶劑+假手術組、鏈脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組（P＜0.01），而接受脲佐菌素誘導Ⅱ型糖尿病+假手術組也顯著高于溶劑+假手術組（P＜0.05）。見圖3。

表1 不同組別血糖及腎功能指標 （±s）Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes in different groups （±s）

表1 不同組別血糖及腎功能指標 （±s）Table 1 Comparison of blood glucose and renal function indexes in different groups （±s）

注：與 溶劑+假手術組比較，#P＜0.05；與溶劑+假手術組比較，*P＜0.05，***P＜0.001

組別溶劑+假手術組T2DM+假手術組T2DM+右腎切除組F組間（P）n888血糖（mmol/L）5.2±0.60 13.16±1.60#14.78±1.81*3.78（0.04）血尿素氮（mmol/L）12.26±1.24 14.18±1.71n.S.21.71±1.69***1.11（0.35）血肌酐（μmol/L）16.49±1.9 18.03±1.53n.S.27.25±3.00*1.38（0.27）

圖1 不同組別AD小鼠腦內海馬區淀粉樣斑塊情況Figure 1 Amyloid plaques in the hippocampus of AD mice in different groups

圖2 同組別Aβ40與Aβ42蛋白表達情況Figure 2 Protein expression of Aβ40 and Aβ42 in the same group

圖3 不同組別AD小鼠腦內海馬區小膠質細胞活化情況Figure 3 The activation of microglia in the hippocampus of AD mice in different groups

3 討論

隨著人口老齡化的發展，糖尿病和AD的發病率逐年提高，而糖尿病是引起終末期腎病最常見的原因，AD合并糖尿病腎病在臨床上并不少見，而且越來越多的證據證明AD 和糖尿病有很多共同之處［13］。中樞神經內神經元上的胰島素受體下調導致的胰島素抵抗可能是AD發病的分子機制之一［14-15］，此外，在AD分子機制中起關鍵作用的β位點剪切酶2同樣在胰腺β細胞內的異常剪切會導致胰島素分泌不足［16］，部分抗糖尿病藥物甚至可以應用在AD的治療上［17］。

慢性糖尿病血糖控制不佳最終會發展成為終末期腎病。基礎研究發現，Toll-like receptor4（TLR4）信號通路調控異常［18］及中樞神經系統內RAS系統激活是糖尿病性腎病和AD 的共同機制［19］。本課題在AD基因背景下采用廣泛認可的方法構建糖尿病性慢性腎損傷模型，模擬臨床中AD 合并糖尿病腎損傷，觀察糖尿病腎病對AD小鼠腦內淀粉樣斑塊及Aβ蛋白表達的影響，發現糖尿病腎損傷促進AD小鼠腦內細胞過度活化，這可能是導致AD小鼠腦內淀粉樣斑塊增高的原因之一。

有報道指出，腦內小膠質細胞的過度不當活化是導致淀粉樣斑塊不能被激活的小膠質細胞有效清除的原因［20］。研究發現小膠質細胞的過度活化可作為AD認知障礙損傷的一個敏感指標［21］，適度控制小膠質細胞的活化及促進M2 樣激化的吞噬作用可促進腦內淀粉樣斑塊的降低，從而達到對AD的免疫調節作用［22］。結合本研究結果推測糖尿病腎損傷可能激活腦內的RAS 系統，通過TLR4 信號通路促進AD小鼠腦內細胞過度活化，從而導致腦內淀粉樣斑塊過度沉積及Aβ 蛋白的表達升高。本研究在動物水平首次發現了糖尿病腎損傷促進AD 小鼠腦內斑塊沉積，加重了AD相關的腦損傷，積極治療DN可減輕AD合并DN患者認知功能下降的進展。