人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞來源外泌體的提取鑒定及微環(huán)境中的攝取

高 遠(yuǎn) 龍妮婭 出良釗 劉 健 董明昊 肖祖沐

1）貴州醫(yī)科大學(xué)外科學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004 2）貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550004 3）貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004 4）貴州省人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550004

膠質(zhì)瘤約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤的80%［1］，基本上是無法治愈的［2］。外泌體在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷和治療中逐漸引起眾多學(xué)者的關(guān)注。外泌體參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理過程，通過作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞及其周圍基質(zhì)細(xì)胞的代謝，促進(jìn)癌癥的進(jìn)展、血管生成、轉(zhuǎn)移、耐藥性和免疫抑制。

外泌體的平均直徑約為100 nm，由雙脂層組成［3］。這種外泌體載體是高度可變的，取決于細(xì)胞類型的來源、細(xì)胞狀態(tài)和其微環(huán)境［4］。外泌體可由細(xì)胞分泌釋放到細(xì)胞外液的微環(huán)境中，從免疫細(xì)胞到腫瘤細(xì)胞［5］。外泌體通過不同的途徑將信息傳遞給受體細(xì)胞：（1）外泌體膜上的蛋白直接與受體細(xì)胞膜上的蛋白接觸，觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)；（2）外泌體胞膜與受體細(xì)胞胞膜融合，釋放其內(nèi)容物進(jìn)入受體細(xì)胞；（3）靶向細(xì)胞直接吞噬外泌體并將其內(nèi)化為組成部分［6］。腫瘤的微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)體系，是腫瘤起始和進(jìn)展各個(gè)階段的積極參與者。越來越多的證據(jù)表明外泌體易從大多數(shù)體液中獲取，包括血液、唾液、尿液、腹水和腦脊液，可作為腫瘤液體活檢具有前途的標(biāo)志物［7］。

近年來，腫瘤微環(huán)境作為預(yù)后因素或治療靶點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。通過外泌體的釋放，腫瘤微環(huán)境通過轉(zhuǎn)移生物活性分子如microRNA 促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。然而越來越多的證據(jù)表明，癌癥的進(jìn)展不僅是由基因改變驅(qū)動(dòng)的，而且由腫瘤細(xì)胞和周圍微環(huán)境共同建立。在膠質(zhì)瘤中，腫瘤微環(huán)境由非腫瘤細(xì)胞組成，如內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)成分、蛋白質(zhì)和分泌因子等，均參與腫瘤細(xì)胞間通訊，從而調(diào)節(jié)疾病的進(jìn)展。癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間強(qiáng)大交叉作用的重要參與者是外泌體。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體，包括mRNA、miRNA 和血管生成蛋白，能夠作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤在微環(huán)境中的發(fā)展。外泌體miRNA 通過調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生相關(guān)。腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的雙向互導(dǎo)通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。在腫瘤微環(huán)境中能量代謝的重編程以及抑制細(xì)胞死亡和免疫反應(yīng)都是眾所周知的癌癥特征。已有研究表明腫瘤微環(huán)境可以預(yù)測預(yù)后，被認(rèn)為是一個(gè)有趣的治療靶點(diǎn)。研究表明，除了改變腫瘤微環(huán)境外，阻斷與腫瘤細(xì)胞雙向互通或重建能夠抑制腫瘤生長的微環(huán)境逆轉(zhuǎn)其表型可能是有用的。

因此，進(jìn)行人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液來源的外泌體的提取、鑒定及觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取外泌體，為后續(xù)外泌體在腫瘤機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 細(xì)胞系購于中科院上海細(xì)胞庫，DMEM 高糖培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），無外泌體胎牛血清（美國BD 公司），0.25%胰蛋白酶（美國BI 公司）。BCA 蛋白測定試劑盒（碧云天生物公司），蛋白快速裂解液和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），CD63（一抗）（英國Abcam）、TSG101（一抗）（英國Abcam）、辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（二抗）（英國Abcam），化學(xué)發(fā)光顯影液（美國BI 公司）。外泌體熒光染色液PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Kit（美國Sigma公司）。低溫智能超速離心機(jī)（Hitachi，日本），透射電子顯微鏡（美國FEI公司TECNAI G2），馬爾文粒度分析儀（英國馬爾文Nanosight NS300 儀），共聚焦顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞培養(yǎng)上清液外泌體的收集將凍存的第5代U251細(xì)胞以含有10%無外泌體血清、100 U/mL青霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。無外泌體血清培養(yǎng)72 h后，收集培養(yǎng)上清液，將120 mL培養(yǎng)基分裝于3個(gè)離心管中。

1.2.2 外泌體的提取：將收集到的培養(yǎng)基分裝于超速離心機(jī)專用的離心管中，4 ℃、300 g 離心10 min 后肉眼可見沉淀為細(xì)胞及細(xì)胞碎片（棄沉淀），吸取上清液于新的離心管中，4 ℃、2 000 g 離心10 min 后肉眼可見沉淀為死細(xì)胞及未除去的細(xì)胞碎片（棄沉淀），吸取上清液于新的離心管中，4 ℃、10 000 g 離心30 min，肉眼可見離心管底部有稍許白色沉淀為細(xì)胞器等微小顆粒（棄沉淀），吸取上清液用0.22 μm 濾膜過濾除去＞200 nm 的顆粒，最后將過濾后的液體4 ℃、100 000 g 離心70 min 離心結(jié)束后得到的沉淀為外泌體及其蛋白質(zhì)，再次重復(fù)上一步驟，離心結(jié)束后得到的沉淀即為分離純化的外泌體。離心結(jié)束后，小心吸盡沉淀上方液體，用100 μL PBS（pH=7.4）緩沖液重懸后儲(chǔ)存于 80 ℃冰箱待用。具體外泌體提取流程圖見圖1。

圖1 外泌體提取流程圖Figure 1 The purification procedure of exosomes

1.2.3 外泌體的鑒定

1.2.3.1 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)及大小：將超速離心法提取的外泌體用50 μL 2%多聚甲醛重懸，吸取10 μL 外泌體懸液滴加于銅網(wǎng)上，室溫靜置5 min。PBS 漂洗3 次，5 min/次。1%戊二醛固定5 min，雙蒸水漂洗2 min，4%醋酸雙氧鈾負(fù)染5 min，濾紙吸去殘液，室溫晾干，透射電鏡下觀察形態(tài)并拍照。1.2.3.2 馬爾文粒度分析儀檢測外泌體大小：首次進(jìn)行外泌體測試前，用純水通過針筒注射器打入樣品池進(jìn)行沖洗工作。沖洗完畢后，對(duì)外泌體進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后將初步稀釋后的外泌體用1 mL注射器打入樣品池中，將整個(gè)樣品池推入主機(jī)內(nèi)，出現(xiàn)納米顆粒布朗運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)圖像，待機(jī)器自動(dòng)讀數(shù)，即可出報(bào)告圖。

1.2.3.3 Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測外泌體表面特異性分子標(biāo)志：Western blotting法檢測外泌體內(nèi)源性蛋白表達(dá)水平：在37 ℃水浴中速溶凍存的外泌體，取100 μL 并迅速加入6×的RIPA 裂解液，混勻后在冰上裂解30 min 后收集于離心管中12 000 r/min 離心20 min。配制BCA測蛋白濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并取5 μL樣品加入到BCA混合液中混勻。將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液體積比按照4∶1混合，置100 ℃沸水浴中加熱10 min。于根據(jù)目的蛋白的大小配置濃度10%或15%的SDS-PAGE 電泳膠中進(jìn)行電泳，結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%封閉液進(jìn)行封閉，加入CD63（1∶500）及TSG101（1∶1 000）單克隆抗體，4 ℃搖床孵育過夜，TBST 室溫下洗膜3 次，10 min/次，之后加入二抗標(biāo)記（1∶4 000），在搖床上室溫孵育2 h，TBST在室溫下洗膜10 min，重復(fù)3次。ECL化學(xué)發(fā)光顯色，用Odyssey 熒光掃描系統(tǒng)檢測PVDF膜的熒光。

1.3 熒光共聚焦顯微鏡觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取外泌體

1.3.1 外泌體染色：將重懸的外泌體加入1 mL DiluentC 液中，同時(shí)將4 μL PKH67 染色液加入1 mL DiluentC 液中，染色10 min。染色結(jié)束后再次移入高速離心管中，4 ℃離心，100 000 g × 70 min，用100 μL PBS磷酸鹽緩沖液將外泌體沉淀重懸即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 熒光共聚焦顯微鏡觀測：將50 μL PKH67 染色的外泌體重懸液加入無外泌體10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中混勻后與U251細(xì)胞共孵育24 h。使用PBS磷酸鹽緩沖液沖洗2次，5 min/次。加入4%的多聚甲醛固定5～10 min 后，用PBS 磷酸鹽緩沖液沖洗3 遍，5 min/次。染色完畢后，吸凈液體。加入1 滴（20 ～50 μL）抗熒光衰減的封閉液，盡量減少氣泡。隨后熒光共聚焦顯微鏡觀察樣品。

2 結(jié)果

2.1 人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞生長狀況以無外泌體血清培養(yǎng)基培養(yǎng)U251細(xì)胞48 h，細(xì)胞貼壁生長緊密，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、圓形、條形等多形態(tài)同時(shí)出現(xiàn)（圖2）。

圖2 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞形態(tài)（×100）Figure 2 The morphology of glioma U251 cells（×100）

2.2 人腦膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞外泌體形態(tài)及大小通過超速離心法得到U251細(xì)胞培養(yǎng)上清中的物質(zhì)，在透射電子顯微鏡下可見直徑30 ～150 nm、外形呈典型的杯狀和雙凹圓盤的扁平球囊體，圓形茶托樣囊泡具有完整的膜結(jié)構(gòu)，均質(zhì)且具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)圓形或橢圓形的囊泡狀結(jié)構(gòu)的小體，內(nèi)部含有低電子密度的物質(zhì)（圖3）。囊泡膜結(jié)構(gòu)清晰可見，符合外泌體的電鏡下特征。

2.3 囊泡的大小U251 細(xì)胞來源的外泌體粒徑大小通過馬爾文粒度分析儀測量，粒徑為54.5 ～255.5 nm，平均143.1 nm，粒徑主峰為148 nm（圖4）。

圖3 U251細(xì)胞來源的外泌體在電鏡下的形態(tài)Figure 3 Morphology of exosomes from U251 cells under electron microscope

2.4 膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞外泌體標(biāo)志蛋白鑒定Western blotting 結(jié)果驗(yàn)證了外泌體特異性標(biāo)志蛋白的表達(dá)，可見CD63、TSG101表達(dá)呈陽性，進(jìn)一步證實(shí)提取的微囊泡是外泌體（圖5）。

2.5 熒光共聚焦顯微鏡觀察膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞攝取外泌體共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)熒光標(biāo)記的外泌體加入到U251 細(xì)胞24 h 以后均能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，說明U251細(xì)胞能有效攝取外泌體，并能清楚觀察到外泌體集中分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖6）。

圖4 外泌體粒徑檢測Figure 4 Particle size identification of exosomes

圖5 膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞上清液及外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)Figure 5 The expression levels of exosomal protein markers in supernatants derived culture media and exosomes

圖6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞攝取熒光標(biāo)記的外泌體Figure 6 Fluorescently labeled U251 exosomes were uptaken by glioma cells

3 討論

外泌體與微泡和凋亡小體不同［8-9］。外泌體的直徑30 ～150 nm，在透射電鏡下呈杯狀。外泌體可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，經(jīng)過配體受體相互作用傳遞信息［8］。外泌體是液體活檢中很有前途的生物標(biāo)志物（蛋白質(zhì)和核酸），包含多種生物標(biāo)志物，代表腫瘤的異質(zhì)性［10］。外泌體可以通過血腦屏障，成為細(xì)胞間通訊的橋梁。研究表明，膠質(zhì)瘤衍生的特異性外泌體作為膠質(zhì)瘤早期診斷的非侵入性候選標(biāo)志物具有巨大的潛力。

外泌體的分離和純化方法包括超速離心法、超濾法、尺寸排斥色譜法和基于微孔板的磁免疫捕獲法［11-12］，目前，超速離心法是分離提純外泌體的主要技術(shù)。雖然沒有統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，但超速離心法在不同的研究中被證明是有效的［13］。外泌體的檢測可通過納米顆粒示蹤分析（NTA）和透射電子顯微鏡（TEM）實(shí)現(xiàn)；此外，可通過相關(guān)蛋白（TSG101 和Alix）、四跨膜蛋白（CD81、CD63和CD9）、細(xì)胞質(zhì)蛋白（Hsp90和Hsp70）、整合素和膜聯(lián)蛋白等外泌體的特異性標(biāo)志蛋白區(qū)分。

越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞主動(dòng)向周圍微環(huán)境釋放外泌體，這些外泌體具有多向性能力，通過重新編程癌細(xì)胞及其周圍基質(zhì)細(xì)胞的代謝，促進(jìn)癌癥快速進(jìn)展、血管生成、轉(zhuǎn)移、耐藥性和免疫抑制［7］。外泌體參與從癌細(xì)胞到其他癌細(xì)胞的信號(hào)傳遞，以及傳播細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化和存活信號(hào)。在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，外泌體可以轉(zhuǎn)移EGFRvⅢ蛋白，幫助野生型細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通過自我促進(jìn)的方式刺激人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖［14］。MA等［15］研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的糖代謝，促進(jìn)了糖酵解，導(dǎo)致其向腫瘤樣表型轉(zhuǎn)化。來自缺氧的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分泌的外泌體易于誘導(dǎo)血管的生成［16］。在膠質(zhì)瘤中，來自惡性細(xì)胞的外泌體已被證明通過在不同癌細(xì)胞亞群之間或癌細(xì)胞與周圍基質(zhì)細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移致癌和免疫調(diào)節(jié)蛋白和核酸，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展［17］。有趣的是，正常乳腺上皮細(xì)胞分泌的外泌體抑制乳腺癌細(xì)胞的外泌體分泌，意味著一種反饋控制維持動(dòng)態(tài)平衡［18］。已有研究證實(shí)，PTRF 不僅在膠質(zhì)瘤組織中，而且在血清外泌體中都可作為診斷性生物標(biāo)志物。PTRF/CD63比值可預(yù)測外泌體分泌，表明其對(duì)膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后和手術(shù)效果具有良好的判定能力。更重要的是，根據(jù)血清外泌體中的PTRF水平診斷膠質(zhì)瘤是微創(chuàng)的，因只需要抽血［19］。

無創(chuàng)診斷是膠質(zhì)瘤患者的迫切需求，外泌體將是癌癥診斷和靶向治療中一種較為理想的生物標(biāo)志物，因其緊密代表了它們親代細(xì)胞的狀態(tài)，在循環(huán)中相對(duì)穩(wěn)定，可以很容易地從體液中收集。外泌體內(nèi)容物作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力已經(jīng)在各種癌癥中進(jìn)行了研究［20］。需要開發(fā)出更快、更便捷的方法驗(yàn)證從人類癌癥患者標(biāo)本中提取的外泌體作為生物標(biāo)志物。利用納米技術(shù)將小分子或用于癌癥治療的藥物裝入外泌體也得到開發(fā)［17］。從合適的供體細(xì)胞獲得大量外泌體的新策略的改進(jìn)，有效地將治療藥物引入外泌體，以及優(yōu)化外泌體靶向輸送到特定組織，將促進(jìn)外泌體作為天然載體在臨床治療中的使用。本實(shí)驗(yàn)成功從人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 培養(yǎng)上清液中提取外泌體并鑒定，通過運(yùn)用激光共聚焦顯微鏡可以清楚觀察到U251 細(xì)胞成功攝取了U251細(xì)胞分泌的外泌體。

通過本實(shí)驗(yàn)成功分離提純出膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的外泌體，并觀察到外泌體在微環(huán)境中的形態(tài)及分布，其集中分布于細(xì)胞質(zhì)中，為外泌體的研究提供進(jìn)一步參考。