不同劑量果王素對肺纖維化小鼠肺間質細胞FGF及VEGF表達水平的影響對比

陳薈婷 賀兼斌

【關鍵詞】果王素;肺纖維化;堿性成纖維細胞生長因子;血管內皮生長因子

肺纖維化是一種具有相似病理過程的一類彌漫性肺間質疾病的總稱，其病理過程中相對復雜，早期病理特征為彌漫性肺泡炎和肺泡結構破壞，增加呼吸衰竭、死亡率[1]。潑尼松是肺纖維化中常用的治療方法，雖然能獲得預期的效果，但是藥物副作用較大，停藥后復發率亦相對較高，導致臨床使用受到限制。果王素為獼猴桃果仁經臨界CO2萃取法提取的果仁油，主要成分為α-亞麻酸，含有一定量的維生素E和微量元素硒等，能發揮抗氧化、抗癌、保護正常細胞活性作用[2]。但是，果王素藥物劑量及對肺纖維化小鼠肺間質細胞堿性成纖維細胞生長因子（FGF）及血管內皮生長因子（VEGF）的影響研究較少[3]。因此，本研究以8周齡SPF級小鼠作為對象，探討不同劑量果王素對肺纖維化小鼠肺間質細胞FGF及VEGF的表達水平的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物資料

購置SPF級小鼠128只作為對象，隨機取8只，設為A組;剩余小鼠建立肺纖維化動物模型，建模成功后隨機分為B組（24只）、C組（24只）、D組（24只）、E組（24只）、F組（24只）。128只SPF級雄性小鼠，體質量（210±15）g，清潔級。動物合格證號：SCXK（湘）2019-0014，將購置的小鼠均放置在醫院動物房進行7 d適應性喂養。且對小鼠進行喂養、12 h交替光照。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計，型號：UV1700，購自于Pharmaspec，ShiMDAzu公司;石蠟包埋機購自武漢俊杰電子有限公司;病理切片機購自于上海徠卡儀器有限公司;顯微鏡購自于日本NiKon公司;TGL-16臺式離心機購自于上海醫用分析儀器廠;HE染色液購自于上海經科化學科技有限公司;潑尼松購自于廣東邦民制藥廠有限公司（國藥準字H44021838）;中華獼猴桃果仁非飽和脂肪酸，購自于湘西老爹生物有限公司，為黃色油性液體，非飽和脂肪酸含量為600 g/L。

1.3 方法

（1）建模方法。128只小鼠隨機取8只為A組，剩余120只小鼠采用注入博來霉素A5建立肺纖維化小鼠動物模型。建模小鼠均給予2%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉，并在無菌操作下正中下切開，充分暴露氣管，行氣管切管，并向氣管內注入一次性博來霉素A5注射液，劑量5 mg/kg，直立小鼠并旋轉，使得藥液在肺內均勻分布，從而完成肺纖維化動物模型;A組則在氣管內一次性注入相同體積0.9%氯化鈉;（2）藥物干預方法。各組小鼠于建模后第二天開始給藥，A組、B組每天給予0.9%氯化鈉2 mL灌胃1次，C組給予5 mg/kg醋酸潑尼松片溶于生理鹽水中，2 mL灌胃;D組取果王素60 mg/ kg混合0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃1次;E組取果王素120 mg/ kg混合0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃1次;F組取果王素180 mg/kg混合0.9%氯化鈉注射液2 mL灌胃1次，每天1次，連續用藥28 d。

1.4 觀察指標

（1）HE染色。6組均完成28 d干預，干預完畢后以斷頸方式處死，取肺部病灶組織。經梯度酒精脫水后進行石蠟包埋，制備4 μm切片，中性樹膠封片后，倒置顯微鏡下觀察甲狀腺的病理形態[4];（2）FGF、VEGF mRNA水平。各組小鼠于干預后7 d、14 d及28 d以斷頸方式處死，取勁動脈血，并采用實時熒光PCR法測定各組小鼠FGF、VEGF mRNA水平，有關操作嚴格遵循試劑盒說明書完成[5]。采用Western Blot檢測各組肺組織中FGF、VEGF 蛋白質的動態表達。

1.5 統計學分析

采用SPSS 24.0軟件處理，計數資料行χ2檢驗，采用[n（%）]表示，計量資料行t檢驗，采用（x—±s）表示，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果比較

各組小鼠均完成相應的處理，并完成HE染色，結果表明：對照組小鼠肺組織中未見肺泡炎、纖維化病變，肺泡結構清晰;模型組可見大量炎癥細胞、肺泡間隔增寬，成纖維細胞大量增生并廣泛纖維化;不同劑量果王素小鼠肺纖維化程度明顯減輕，且高劑量與潑尼松小鼠改善最佳，見圖1。

2.2 FGF、VEGF mRNA水平及蛋白比較

各組小鼠均給予相應的措施處理，并完成FGF、VEGF mRNA水平測定，結果表明：隨著時間的延長不同劑量果王素組與潑尼松組FGF、VEGF mRNA水平呈下降趨勢，不同時間點FGF、VEGF mRNA水平比較具有統計意義（P<0.05）;F組和C組FGF、VEGF mRNA水平無統計意義（P>0.05）;F組FGF、VEGF mRNA水平均低于D組和E組（P<0.05），見圖2。

Western Blot檢測結果表明：不同劑量果王素組與潑尼松組FGF、VEGF蛋白呈低表達;F組和C組FGF、VEGF蛋白無統計意義（P>0.05）;F組FGF、VEGF蛋白均低于D組和E組（P<0.05），見圖3。

3 討論

獼猴桃是世界公認的“水果之王”“世界珍果”，其營養豐富、全面，主要體現為“兩高四多”，即：高鉀、高鈣、多亞麻酸、多維生素C、多粗纖維及多氨基酸。同時，獼猴桃種子中含有其核心營養物質α-亞麻酸，能通過“稀釋血液”，調節血脂中過高的甘油三酯水平，保護心臟健康。現代藥理結果表明[6]：果王素具有抗氧化、抗炎癥及抗腫瘤等多種生物學效應，藥用價值較高。本研究中，B組可見大量炎癥細胞、肺泡間隔增寬，成纖維細胞大量增生并廣泛纖維化;不同劑量果王素小鼠肺纖維化程度明顯減輕，且高劑量與潑尼松小鼠改善最佳，從本研究結果看出，果王素用于肺纖維化小鼠中，能減輕肺損傷，且作用效果多呈劑量依賴性，能獲得良好的預后。

FGF主要由內皮細胞、巨噬細胞與平滑肌細胞分泌產生，具有多種異構體，在動脈粥樣硬化病灶中發揮了重要作用。既往研究表明[7]：FGF能促進內皮細胞的游走、平滑肌細胞的增殖，避免平滑肌細胞游走。同時，FGF亦可促進新生血管形成，修復損害的內皮細胞，被認為是病灶形成促進因子。而VEGF又稱為血管通透因子，是一種高度特異性促進血管內皮生長因子，能促進血管通透性增加、細胞外基質變性、血管內皮細胞的遷移、增殖及血管的形成作用。FGF、VEGF在人體中呈低表達或處于動態平衡狀態，但是在肺纖維化中能引起FGF、VEGF mRNA水平持續升高，其表達水平能反映肺纖維化的疾病嚴重程度，可指導臨床治療[8]。本研究中，隨著時間的延長不同劑量果王素組與潑尼松組FGF、VEGF mRNA水平呈下降趨勢，不同時間點FGF、VEGF mRNA水平比較具有統計意義（P<0.05）;F組FGF、VEGF水平均低于D組和E組（P<0.05）;Western Blot檢測結果表明：不同劑量果王素組與潑尼松組FGF、VEGF蛋白呈低表達;F組和C組FGF、VEGF蛋白無統計意義（P>0.05）;F組FGF、VEGF蛋白均低于D組和E組（P<0.05），從本研究結果看出，果王素能降低肺纖維化小鼠FGF、VEGF mRNA水平，且高劑量果王素效果最佳，干預過程中加強FGF、VEGF mRNA水平測定，亦可評價小鼠預后。

綜上所述，果王素用于肺纖維化小鼠中能減輕肺損傷，且呈劑量依懶性，可能與抑制FGF、VEGF mRNA水平有關，能為肺纖維化治療提供新思路。