基于非人靈長類動物模型的缺血性腦卒中治療方法研究☆

秦振秀 劉競麗

目前臨床上首選重組組織纖溶酶原激活劑（recombinant tissue-type plasminogen activator，rt-PA）[1]或血管內血栓切除術（endovascular thrombectomy，EVT）[2]治療缺血性腦卒中，但這些治療遠不能使絕大多數患者獲益。因此需要找到其他有效的治療方法來改善更多患者的預后。然而絕大多數在嚙齒動物上有效的干預措施在臨床試驗中都失敗了，這可能與嚙齒動物在解剖學、遺傳學、病理學以及藥理學等各方面都與人差別大有關，而非人靈長類動物在各方面都與人類相近。所以使用非人靈長類動物對缺血性腦卒中的治療方法進行有效性及安全性評價是進入臨床研究的關鍵一步，目前這方面的研究較少。因此，本文將對以非人靈長類動物為模型的缺血性腦卒中的治療方法研究進展進行綜述。

1 藥物療法

目前在非人靈長類動物模型上研究的藥物按機制分為酶/蛋白抑制藥物；抗血栓形成的藥物；清除自由基的藥物；以及干預其他機制的藥物，絕大多數這些藥物治療都能減少梗死面積以及改善神經功能，他們都可作為治療缺血性腦卒中的主要候選藥物。以下具體介紹每種藥物的藥效作用特點。

1.1 酶/蛋白抑制藥物 4-（（1E）-2-（5-（4-羥基-3-甲氧基苯基-）-1-苯基-1 h-吡唑基-3-基）乙烯基）-2-甲氧基苯酚[4-（（1E）-2-（5-（4-hydroxy-3-methoxystyryl-）-1-phenyl-1H-pyrazoyl-3-yl）vinyl） -2-methoxy-phenol），CNB-001]是一種姜黃素化合物，具有親脂性和穿透血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的藥物化 學特性[3]，CNB-001在體外可抑制人 5-脂氧合酶 （5-lipoxygenase，5-LOX）和15-脂氧合酶（15-lipoxygenase，15-LOX），而 5-LOX 在大腦中含量豐富，其產物5-HPETE轉化為白三烯，介導炎癥和氧化應激[4]。LAPCHAK等[5]在雄性食蟹猴永久性大腦中動脈（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）阻塞中表明在6 h內給予CNB-001治療，能有效的減少腦梗面積的擴大。但還需進一步在非人靈長類動物模型上評估CNB-001與其他治療缺血性腦卒中的藥物聯合作用下的療效和安全性。

MP-124是聚腺苷酸二磷酸核糖基聚合酶 （poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑，有研究顯示MP-124在食蟹猴pMCAO和短暫大腦中動脈阻塞（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）術后 6 h內均表現出明顯的神經保護作用，而且無性別差異，也初步探討了tMCAO術后8 h給予MP-124仍有統計學意義，但其效力低于6 h，MP-124是一種不僅能改善梗死面積，還能改善非人類靈長類動物缺血性卒中模型的神經功能缺損的藥物，在tMCAO模型再灌注后PARP被強烈激活[6]。所以MP-124作為PARP的抑制劑更適合與血管再通治療方式協同應用，減少缺血再灌注帶來的進一步損傷，并且MP-124的神經保護作用可持續較長時間。

PSD-95是一種突觸支架蛋白，它將N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）與神經毒性信號通路連接起來[7]。NA-1（又稱Tat-NR2B9c）是PSD-95抑制劑，通過干預PSD-95的蛋白-蛋白相互作用而發揮作用，COOK等[8]通過MRI、組織學來評估獼猴發生缺血性腦卒中后的神經功能和組織損傷，該研究證明了PSD-95抑制劑對非人靈長類動物大腦的神經保護作用。NA-1是一個非常有潛力的治療缺血性腦卒中的新藥物，目前已進入二期臨床試驗[9]，臨床試驗表明NA-1對血管痙攣沒有作用，NA-1相關的神經功能改善機制被認為是直接的神經元保護，NA-1尤其對蛛網膜下腔出血后的神經功能改善更顯著。

1.2 抗血栓形成的藥物 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）是戊糖磷酸途徑的代謝產物，是參與細胞內多種合成代謝反應的輔酶和經典分子。外源性NADPH能夠阻止缺血/再灌注期間細胞內ROS水平的升高，此外，當有氧時，線粒體可以利用過量的NADPH產生ATP[10]。LI等[11]在雄性恒河猴血栓栓塞大腦中動脈模型的研究上，表明了NADPH可以抑制血小板的聚集，還可以減少10 d后梗死體積。但目前對于該藥還只是初步探究，NADPH在非人靈長類動物使用的安全性，有效性等方面還有待深入研究。

第三代噻吩吡啶類抗血小板藥物普拉格雷（prasugrel）是P2Y12拮抗劑，有研究[12]提示在食蟹猴血栓性腦卒中模型上使用 1 mg/（kg·d）以及 0.3 mg/（kg·d）的普拉格雷可以減少腦梗死體積，改善神經功能，卻不增加出血風險，研究表明，普拉格雷單藥治療對預防血栓性腦卒中是有效的。2016年SUGIDACHI等[13]研究了普拉格雷的活性代謝物R-138727可以增加再灌注的血管再通率，并且普拉格雷抗血小板作用的三期隨機非劣效性試驗已經在日本完成[14]。相對于氯吡格雷，普拉格雷最主要對標準抗血小板治療反應不良的患者有效，特別是那些CYP2C19功能下降的患者。

人源抗E/P選擇素抗體（humanized anti-E/P-selectin antibody，HuEP5C7）是一種選擇性阻斷E/P選擇素的抗體，選擇素在血栓形成中介導白細胞粘附，參與微血管血栓形成，HuEP5C7抑制中性粒細胞與表達E和P選擇素的細胞因子激活的內皮細胞的結合，以及P選擇素介導的血小板結合。給予HuEP5C7治療的狒狒不僅可以減少梗死面積、改善神經功能和增加存活率，更重要的是它可以顯著抑制外周選擇素水平和減少腦中性粒細胞內流。從而減少腦梗死動物的感染風險[15]。

水蘇霉小孢子三丙烯基苯酚（stachybotrys microspora triprenyl phenol，SMTP）是一小孢子水霉屬真菌的一個小分子家族。SMTP-7是一種有效的SMTP同源物，有研究[16]通過在食蟹猴血栓性腦卒中模型中，注射SMTP-7顯著提高了灌注后再通率，但SMTP-7對食蟹猴腦卒中模型的療效不涉及血流動力學改變和凝血抑制，SMTP-7是通過改變纖溶酶原的構象，使其易受內源性纖溶酶原激活劑的蛋白水解激活而發揮作用。SMTP-7作為有潛力的溶栓藥需要進一步與rt-PA進行再通和出血性轉化比例的比較。SMTP-7能否真正降低出血的風險以及SMTP-7對神經功能缺陷長期預后的影響也都需要再進一步深入研究。

1.3 清除自由基的藥物 2-（（（1，1-二甲基乙基）氧化亞氨基）-甲基）-3，5，6-三甲基吡嗪[2-（（（1，1-dimethylethyl）oxidoimino）-methyl）-3，5，6-trimethylpyrazine，TBN]是一種新型的四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP）和硝基酮的合成物，TBN同時具有TMP和硝基酮的藥理特性，具有強大清除自由基的功能。TBN很容易穿透血腦屏障，TBN可以有效地進入損傷的腦組織，既抑制Ca2+內流，又清除自由基。有研究[17]證明TBN在雄性食蟹猴腦卒中發生后6 h仍然有效，TBN治療除能顯著減少腦梗死體積外，還可恢復食蟹猴癱瘓手臂的抓食功能。TBN對血小板聚集有邊緣作用，與阿司匹林沒有協同作用。基于TMP在臨床使用中的安全性以及TBN的臨床前安全性評價，初步推測TBN在人體是安全的，且副作用小。TBN治療缺血性腦卒中的臨床前療效有待于臨床試驗進一步驗證。

1.4 其他機制的藥物 N-（（3R）-7-（（1R）-1-羥乙基）-3-（4-異丙基苯基）-4，6-二甲基-2，3-二氫-1-苯并呋喃-5-基）-3，3-二甲基丁酰胺）[（N-（（3R）-7-（（1R）-1-Hydroxyethyl）-3-（4-isopropylphenyl）-4，6-dimethyl-2，3-dihydro-1-benzofuran-5-yl）-3，3-dimethylbutanamide），TAK-937]是一種選擇性高效的大麻素（cannabinoid，CB）受體激動劑，SUZUKI等[18]在獼猴大腦中動脈血栓栓塞模型研究中，證明了TAK-937能夠減少梗死體積和腦脊液中s-100β的水平，而且腦脊液中s-100β水平與梗死體積呈正相關。提示s-100β可作為未來TAK-937臨床前/臨床應用的替代生物標記物。但TAK-937在與人類卒中相關的共病（如高血壓和糖尿病）中減少缺血性損傷的能力仍有待證實。

CNTO-0007是含有人臍組織來源細胞 （human umbili cal tissue-derived cells，hUTC）的一種細胞藥物，hUTC 包含間充質祖細胞、內皮細胞前體和其他具有廣泛增殖能力的未成熟祖細胞，這些細胞可以分化為神經細胞，分泌神經營養因子，并產生細胞因子，如趨化因子、白介素和生長因子，這些因子最終可以調節炎癥、血管生成和突觸生成，并減少卒中后細胞死亡[19]。MOORE等[20]研究了細胞藥物CNTO-0007對恒河猴皮質缺血后功能恢復的影響，結果表明CNTO-0007可以改善恒河猴的精細功能，特別是對抓握功能的影響，但這種恢復的確切機制仍不清楚。該藥物仍然需要在非人靈長類動物模型上進行更深入的機制研究。

人羊膜上皮細胞（human amniotic epithelial cells，hAECs）是胎盤來源的干細胞。hAECs突破了其他干細胞治療的一些限制，比如免疫排斥反應、腫瘤形成、來源和可用性有限、倫理問題，hAECs可以有效預防卒中后全身免疫抑制，hAECs是一種比許多其他干細胞類型更安全的移植細胞[21]。有研究證明hAECs可以有效地抑制狨猴腦皮質短暫性缺血模型梗死灶的擴大[22]。羊膜上皮細胞療法已經完成了在缺血性腦卒中的一期臨床實驗[23]。靜脈注射羊膜上皮細胞治療缺血性腦卒中未來可期。

2 其他非藥物療法

遠端缺血后處理（remote ischemic postconditioning，RIPC）是一種非藥理學方法，通過間歇性和非侵入性阻斷肢體的血流來改善神經功能。有研究[24]表明短期RIPC在恒河猴缺血性腦卒中模型超急性期是安全有效的，RIPC可改善恒河猴腦卒中后30～60 d的神經功能，但對腦梗死體積無影響。與單肢RIPC/四肢RIPC相比，雙肢RIPC聯合兩個訓練周期在減少心肌酶、血管內皮損傷和炎癥反應方面更有效。考慮到這一點，在卒中超急性期應用雙肢RIPC似乎是減少卒中相關的心功能障礙和神經功能缺損的一種有希望的治療策略。RIPC具有無創，成本低，使用方便的特點，希望有條件可以進一步對其深入研究。

SHIMIZU等[25]首次報高了經顱靶向-低頻超聲溶栓（transcranial targeting-low frequency ultrasound thrombolysis，TCT-LoFUT）在食蟹猴以及恒河猴正常大腦中的臨床前安全性檢測。通過組織學證據支持TCT-LoFUT沒有對健康的非人靈長類動物造成大腦腫脹、壞死等不良影響。TCT-LoFUT無創，且同時可以達到診斷與治療缺血性腦卒中的目的，但是在不正確的聲學條件下使用它可能會導致嚴重的腦損傷。所以TCT-LoFUT在非人靈長類動物的安全性研究還需繼續。

3 小結

缺血性腦卒中是一種簡單而明確的病理狀態，血流中斷導致組織連續損傷，另一方面，缺血性腦卒中又是一種高度復雜的疾病[26]。許多臨床前研究絕大多數臨床前研究都失敗了，原因包括神經保護藥物只在年輕動物身上進行測試，這并不能模擬老年人類中風的所有方面，同時嚙齒類動物在解剖學，遺傳學，病理生理等各方面都與人類相差甚遠，還包括卒中模型只是單純的卒中，但是臨床上的卒中通常會合并高血壓，糖尿病等其他疾病。這些可能都是導致在動物模型上有很好的療效，但在臨床前試驗總是失敗的原因[27]。所以非人靈長類動物缺血性腦卒中模型是特別有價值的工具。本文總結了到目前為止以非人靈長類動物為模型的缺血性腦卒中的一些藥物以及非藥物治療研究，它們治療缺血性腦卒中各有利弊，但研究并不全面，想要應用到臨床試驗階段還需要對它們進行深入研究。建議在非人靈長類動物模型上建立共病的卒中模型，將這些神經保護藥物與溶栓藥物相結合，評價這些藥物的療效以及安全性。同時，非人靈長類動物作為研究對象，成本昂貴，造模技術要求高，動物護理還需要專業人員支持，希望有能力有資源的研究者們能突破難關，在未來的缺血性腦卒中的臨床研究中能有重大突破。