枸杞多糖對LPS誘導的人視網膜色素上皮細胞炎性反應的影響及機制

閆 梅，馬 倩，馬雅玲,，劉 媛，馬立萍

0引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種影響視網膜黃斑區，導致中央視力逐漸喪失的疾病，多發生于60歲以上的人群中，是造成視覺損害的主要原因之一[1-2]。我國現已步入老齡化社會，人口老齡化呈指數增長，其患病率將進一步上升。研究發現，ARMD的發病機制涉及氧化應激、光損傷、炎癥、遺傳基因等方面[3-5]。其中，視網膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)的炎性損傷是重要環節[1,3]。RPE具有維持視網膜感光細胞層的功能，可保護視網膜免受過度光照，并參與形成血-視網膜屏障及視網膜中央黃斑的免疫防御等[4-5]。研究表明，各種刺激形成的RPE炎性損傷能夠促進新生血管生成，加速病情進展為滲出性ARMD[3-6]。所以，抑制RPE細胞內炎性損傷，同時預防RPE的丟失，是開發治療ARMD新方案的關鍵。研究證實，枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)具有抗炎、抗氧化應激、抗衰老等作用[7-9]。本課題組既往研究也表明枸杞多糖對糖尿病大鼠視網膜具有保護作用，對氧化應激造成視網膜神經節細胞的凋亡具有抑制作用[10-11]，但是，枸杞多糖對RPE炎性反應的影響尚不明確。所以，本實驗通過細菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激人視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞構建ARMD的體外炎癥反應模型，探索枸杞多糖對RPE炎性反應的影響及機制，為治療滲出性ARMD及RPE炎癥相關疾病提供新思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1主要試劑ARPE-19細胞株(中科院上海細胞庫)、枸杞多糖(寧夏沃福百瑞)、LPS(美國Sigma)、胎牛血清(美國Gibco)、DMEM-F12培養基(美國Hyclone)、0.25%胰蛋白酶+EDTA(索萊寶)、青-鏈霉素混合液(100×)(索萊寶)、RT-PCR逆轉錄試劑盒(Invitrogen)、SYBR Green qPCR Master Mix(DBI Bioscience)、總RNA提取試劑盒(北京天根)、引物(上海生工)、CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(上海貝博)、全蛋白提取試劑盒(凱基生物)、BCA蛋白定量試劑盒(凱基生物)、ECL高敏檢測試劑盒(凱基生物)。一抗：p-IκBα、IκBα、p-ERK、p-p38及p-JNK(Affinity，CAT：5002、2002、1015、4001、3318)，p-p65、p65(CST，CAT：3033、8242)，ERK、p38及JNK(萬類生物，CAT：01864、00764、01295)，β-Actin(中杉金橋，CAT：TA-09)。

1.1.2儀器Infinite M200 Pro酶標儀(瑞士TECAN)、PowerPac 200電泳儀(美國Bio-Rad)、IQ5 Real-Time PCR儀(美國Bio-Rad)、ChemiDoc Touch化學發光成像系統(美國Bio-Rad)。

然而,企業減排導致生產成本增加,成本增加導致國際競爭力下降,國際競爭力下降導致國內經濟現代化受阻。不減排,國際輿論壓力大,綠色貿易壁壘愈演愈烈,在國際分工中將長期處于產業價值鏈的低端水平,國內經濟也無法實現高質量發展。

1.2方法

1.2.1 ARPE-19細胞培養收到ARPE-19細胞后放置入培養箱，于37℃、5% CO2條件下培養，待細胞密度約為85%時使用胰酶進行消化，1200r/min離心5min，1∶3傳代，接種于T25培養瓶中，加入完全培養基培養(10% FBS，1%青-鏈霉素混合液，89% DMEM-F12)，2d換液一次，穩定傳代后取2～4代用于實驗。同時，細胞密度為85%時進行消化離心，加入凍存液(10% DMSO，90% FBS)重懸，放入-80℃冰箱凍存，次日投入液氮長期保存。

1.2.2實驗分組及處理將細胞隨機分為空白組、LPS組、低濃度LBP組、中濃度LBP組、高濃度LBP組。所有分組加藥前均使用不含血清的培養基饑餓24h。空白組使用完全培養基培養，與其余組同時換液；LPS組給予含10μg/mL LPS的完全培養基刺激24h；LBP組分別給予含有低濃度LBP(0.1mg/mL)、中濃度LBP(0.5mg/mL)及高濃度LBP(1mg/mL)的完全培養基孵育24h，再以同樣方式給予10μg/mL LPS作用24h。

1.2.3 CCK-8觀察各組細胞存活率細胞以濃度為1×104個/mL接種于96孔板中，每孔加入200μL培養基，培養24h，待細胞貼壁后PBS沖洗兩遍并給予無血清DMEM培養基饑餓24h。各組處理同上，處理后PBS沖洗換液加入含10% CCK-8的無血清培養基，37℃培養箱中避光孵育2h，酶標儀450nm檢測OD值，使用公式：細胞存活率=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100%，計算出細胞存活率。

1.2.4 Real Time-PCR檢測各組細胞內炎性因子的mRNA表達量上述各組細胞接受處理后按照天根總RNA提取試劑盒步驟過柱提取，提取后測定RNA濃度并用瓊脂糖凝膠電泳驗證純度后，每組取等量RNA參照Invitrogen逆轉錄試劑盒步驟，進行逆轉錄合成為cDNA，-80℃保存。使用DBI SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒，嚴格按照步驟，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。引物序列見表1。反應體系為：20μL。采用試劑盒中標準三步法進行Real Time-PCR擴增，反應條件為：預變性，95℃ 2min；PCR反應，95℃ 10s，50℃～60℃ 30～34s，72℃ 30s，共40循環。熔解曲線，55℃～98℃ 84循環。得出Ct值，以GAPDH為內參，使用相對定量法，計算2-△△Ct值。

1.2.5 Western-blot檢測各組蛋白表達量各組細胞接受處理后，根據全蛋白提取試劑盒步驟，冷PBS洗滌細胞2次，加入提前配置的裂解液并刮出細胞，收集懸液放置冰上，間隔4min震蕩一次，每次持續1min，循環5次。離心機12000r/min、4℃離心20min取上清液，依照BCA蛋白定量試劑盒步驟進行蛋白定量。定量后加入5×上樣緩沖液，100℃變性5min備用。配制10% SDS-PAGE凝膠，取40μg蛋白(p-p65、p65、p-IκBα、IκBα)或80μg蛋白(p-p38、p-ERK、p-JNK、p38、ERK、JNK)上樣，加入電泳液，連接電泳儀調整電壓為80V進行電泳，至分離膠時轉120V電泳至底部，打開切膠進行轉膜(PVDF膜，濕轉，220mA，60min)，5%脫脂奶粉或5% BSA溶液(磷酸化蛋白)封閉4h，洗膜(0.1% PBST 5min，重復3次)后一抗封閉過夜，第2d洗膜后二抗孵育2h，再洗膜，取出表面滴ECL發光液進行曝光。一抗濃度：p-p65、p65、p-IκBα、IκBα、p-p38、p38及p-ERK(均1∶1000)，p-JNK及JNK(1∶800)，ERK(1∶500)，β-Actin(1∶1000)。二抗濃度：1∶10000。使用Image J軟件分析條帶，p-p65與p65比值，p-IκBα、IκBα與β-Actin比值進行計算，p-p38、p-ERK及p-JNK分別與p38、ERK和JNK比值進行計算。

2結果

2.1枸杞多糖對LPS誘導下ARPE-19細胞活力的影響空白組、LPS組、低濃度LBP組、中濃度LBP組、高濃度LBP組細胞存活率分別為(96.33±6.51)%、(61.79±19.78)%、(107.58±40.47)%、(118.29±34.42)%、(114.01±20.70)%，差異有統計學意義(F=3.496，P=0.026)。與空白組相比，LPS組細胞存活率下降，但差異無統計學意義(P>0.05)。相較于LPS組，各LBP處理組細胞存活率升高，均大于80%，差異有統計學意義(P<0.05)，但各濃度處理組之間相比差異均無統計學意義(P>0.05)，表明一定濃度的LBP對LPS誘導ARPE-19細胞的炎性損傷具有抑制作用，見圖1。

圖1 枸杞多糖對LPS誘導ARPE-19細胞活力的影響 a P<0.05 vs LPS組。

圖2 枸杞多糖對LPS誘導ARPE-19細胞內炎性因子的影響 A：IL-6的mRNA表達量；B：IL-1β的mRNA表達量；C：MCP-1的mRNA表達量。 b P<0.01 vs LPS組。

表1 RT-PCR引物序列

2.2各組細胞內炎性因子mRNA表達量的變化各組細胞內炎性因子IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA表達量比較，差異均有統計學意義(P<0.001)，見表2。其中，LPS組表達量較空白組均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.001)；與LPS組相比，低、中、高濃度LBP組的IL-6及MCP-1表達量均明顯下降，高濃度LBP組的IL-1β表達量也明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。但各因子的三個LBP濃度組之間進行比較，表達量未見明顯變化，差異均無統計學意義(P>0.05)。可見，在轉錄水平，LBP能夠抑制LPS誘導的ARPE-19細胞中炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的表達，而此作用與LBP的劑量無關，見圖2。

表2 各組細胞內炎性因子mRNA的表達

圖3 枸杞多糖對LPS誘導的ARPE-19細胞內NF-κB通路相關因子蛋白表達量的影響 A：p-p65相對蛋白表達量；B：p-IκBα相對蛋白表達量；C：IκBα相對蛋白表達量；D：蛋白表達檢測條帶。a P<0.05，b P<0.01 vs LPS組。

表3 各組細胞內NF-κB/MAPK通路相關蛋白的表達

2.3各組細胞內NF-κB/MAPK通路相關蛋白表達量的變化

2.3.1 NF-κB通路各組NF-κB通路的p-p65、p-IκBα及IκBα蛋白表達水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05，表3)。LPS組的p-p65、p-IκBα表達水平較空白組明顯升高，而IκBα蛋白表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與LPS組相比，低、中、高濃度LBP組的p-p65表達量均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與低濃度LBP組比較，高濃度LBP組的p-p65、p-IκBα蛋白表達量均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，可見LBP的作用隨濃度升高而增強；同時，高濃度LBP組的IκBα表達量較LPS組升高，而p-IκBα表達量降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明LBP能夠抑制IκBα蛋白向p-IκBα轉化。所以，枸杞多糖能夠抑制LPS刺激ARPE-19細胞NF-κB通路的激活，并可通過抑制NF-κB通路相關蛋白p65、IκBα的磷酸化發揮效應，且呈現出LBP劑量依賴性，見圖3。

2.3.2 MAPK通路檢測各組MAPK通路磷酸化因子的蛋白相對表達量進行比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。與空白組相比，LPS刺激后p-JNK、p-ERK及p-p38的蛋白表達量升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與LPS組相比較，低、中、高濃度LBP組p-p38的蛋白表達量可見明顯下降，中、高濃度LBP組p-JNK的蛋白表達量降低，并且在高濃度LBP組的細胞中p-ERK的蛋白表達量有所減少，差異均具有統計學意義(P<0.05)；比較低濃度LBP組與高濃度LBP組，發現三種磷酸化蛋白表達量隨著LBP濃度的升高均有降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。由此可見，枸杞多糖能夠抑制LPS刺激ARPE-19細胞內JNK、ERK及p38的磷酸化，并具有劑量依賴性，揭示枸杞多糖可通過JNK/ERK/p38通路抑制LPS誘導的ARPE-19炎性反應。

圖4 枸杞多糖對LPS誘導的ARPE-19細胞內MAPK通路相關因子蛋白表達量的影響 A：p-JNK相對蛋白表達量；B：p-ERK相對蛋白表達量；C：p-p38相對蛋白表達量；D：蛋白表達檢測條帶。a P<0.05, b P<0.01 vs LPS組。

3討論

LBP具有明確的抗炎作用，研究發現它可通過抗炎、抗氧化和抗凋亡等機制發揮神經保護作用[12-13]。在小鼠巨噬細胞中，LBP可通過抑制TLR4/NF-κB信號通路減輕LPS誘導的炎性反應[14]；并且，LBP可通過MAPK通路調節促炎細胞因子的變化，進而抑制小鼠肝腦損傷及運動障礙[15]。眼科研究中，已證實雷公藤、血管緊張素轉換酶2激動劑等藥物可通過NF-κB/MAPK通路抑制LPS誘導的RPE炎癥性反應[16-17]。所以，我們采用LPS誘導ARPE-19細胞建立炎性反應模型觀察LBP的作用，證實LPS可誘導ARPE-19發生炎性損傷、細胞存活率下降，并且發現一定濃度的LBP預處理能提高炎性損傷后的RPE細胞活力。而且，LPS與LBP同時應用并未降低細胞活力，證實了LBP應用的無毒性，這可為預防RPE的炎性損傷提供一種安全的新藥物。

在ARMD的機制及治療研究中，炎性因子一直受到廣泛關注。近年研究發現，眼部衰老相關疾病可伴隨有IL-6、IL-1β及MCP-1等炎性因子的增加[18-19]；有人使用IL-1β刺激RPE細胞，發現IL-6、IL-8及MCP-1等炎性因子的升高[20]；還發現通過LPS刺激RPE細胞也可出現IL-6、IL-8及MCP-1等升高[17-21]。而在本實驗中，我們也觀察到LPS誘導ARPE-19細胞后，細胞內炎性因子IL-6、IL-1β及MCP-1的表達量明顯升高，并且發現 LBP可發揮明顯的抗炎作用，降低這些炎性因子的表達，為LBP能夠抑制RPE細胞的炎性反應提供了有力證據。另外，細胞產生炎性反應時，幾乎都存在NF-κB通路的激活。比如LPS刺激細胞后，可與細胞表面的Toll樣受體結合，激活IκBα激酶，合成IκBα復合物，進一步誘導IκBα磷酸化、泛素化，后被相應蛋白酶識別降解，使得p50/p65從IκBα復合物中釋放出來，形成p50/p65二聚體，再迅速發生核轉位，由p65形成p-p65，最后啟動細胞核中如TNF-α、IL-1β、IL-6及MCP-1等細胞炎性因子的靶基因表達[22-24]。在本實驗中我們觀察到LPS誘導后ARPE-19細胞中IκBα、p65的磷酸化水平升高，進一步證實LPS能夠通過誘導RPE細胞中NF-κB通路的激活發揮其致炎作用。在此基礎上新發現LBP可上調RPE細胞中IκBα蛋白水平，下調磷酸化因子p-IκBα、p-p65的表達，表明LBP能夠抑制胞內NF-κB通路激活、阻礙IκBα及p65向磷酸化轉化。此結果明確了在RPE細胞中，LBP的抗炎作用機制可通過抑制NF-κB通路進行。并且我們還對LBP在三個濃度梯度下的抗炎作用進行了研究，發現濃度越高，LBP抑制NF-κB通路激活的作用越強。這顯示出LBP的抗炎作用存在劑量依賴性，可為下一步進行體內及臨床研究時選擇藥物濃度提供參考。

MAPK通路與細胞增殖、應激、炎癥、凋亡等信號轉導通路密切相關。作為這些通路的交匯點，它將胞外信號經受體、G蛋白、蛋白激酶、轉錄因子等組成信號網絡，傳遞到胞內，參與細胞分化、癌變、遷移、凋亡等細胞病理生理過程。MAPK通路是信號從細胞表面到細胞核內部的重要傳遞者，分為ERK、p38、JNK和ERK5等亞族，其激活通過級聯過程進行，被激活后表現為逐級的磷酸化[25]。研究表明，LPS刺激可通過激活細胞內信號通路適配器MyD88蛋白的表達進行，再啟動下游信號轉導級聯，引起MAPK通路中p-JNK、p-ERK及p-p38的激活[26-27]。我們的實驗結果也證實了這一點。同時發現LBP可降低LPS刺激后RPE細胞內JNK、ERK及p38的磷酸化表達，這顯示LBP是通過抑制MAPK中亞級通路JNK/ERK/p38的激活來降低RPE炎性反應。除此之外，不同濃度LBP作用強度不同，在低濃度LBP的處理下抑制MAPK通路激活的作用并不明顯，但在高濃度LBP組中，三種因子的磷酸化表達均有很大程度的減低，所以，LBP的抗炎作用與藥物用量密切相關。再者，由于MAPK通路與細胞增殖及凋亡聯系緊密，所以ARMD中RPE細胞的炎癥相關死亡方式也值得關注。

本實驗雖然得出細胞水平的結論，無體內實驗證據，但可為下一步繼續深入探討LBP對ARMD中炎癥方面的作用提供基本依據。基于細胞實驗，還可進行細胞死亡方式的研究，并觀察其他可能參與RPE炎性反應的信號通路，為ARMD及眼科RPE相關炎癥性疾病的治療提供新靶點。

綜上所述，枸杞多糖對于LPS誘導的人視網膜色素上皮細胞炎性反應具有抑制作用，并通過抑制NF-κB/MAPK通路相關因子的磷酸化及阻礙細胞內炎性因子IL-1β、IL-6及MCP-1的轉錄過程而發揮影響。