外泌體在免疫介導性眼病中的研究進展

劉 笑，馬詩思，鐘敬祥

0引言

眼睛由于存在血眼屏障、缺乏淋巴引流系統等原因，常常被認為是免疫赦免器官。盡管如此，眼部仍可發生嚴重的免疫介導性眼病(immune-mediated eye diseases,IMED)，如甲狀腺相關眼病(thyroid-associated ophthalmopathy,TAO)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis,AU)及Sj?gren綜合征(Sj?gren syndromes,SS)等，輕則影響患者的日常生活，重則引起嚴重的視力損害，甚至失明。現階段，臨床上以糖皮質激素及免疫抑制劑為主的治療方法療效欠佳、且易復發，因而亟需開拓該類疾病的診治思路與策略。外泌體是一種由細胞分泌的脂質雙分子層囊泡，其中包含蛋白質、脂質及核酸等生物活性分子，在細胞間通訊起著重要的媒介作用[1]。既往研究發現，外泌體具有重要的炎癥及免疫調節作用[2]。一方面，病損細胞分泌的外泌體密切參與了IMED的發生與發展；另一方面，某些細胞(如間充質干細胞)分泌的外泌體還可用于IMED的治療。因此，本文擬對外泌體在IMED中的研究進展作一綜述。

1外泌體概述

1.1外泌體的來源與組成細胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)根據其生物學來源和大小可分為外泌體、微囊泡及凋亡小體。三者的直徑差別較大，外泌體一般為30～150nm，微囊泡為100～1000nm，而凋亡小體分子直徑常>1000nm，發揮的生物學功能也有差異[3]。近年來，外泌體在疾病中所發揮的作用受到了越來越多人的關注。外泌體首次于1983年由Johnstone等[4]在綿羊網織紅細胞上清液中發現，廣泛存在于多種體液中[5-6]，其中就包括眼睛的房水、淚液、玻璃體等[7-9]。此外，外泌體攜帶有豐富的蛋白質，包括廣譜蛋白和特異性蛋白。廣譜蛋白與細胞來源無關，而特異性蛋白與細胞的來源相關，可以反映組織細胞的特異性，如T細胞來源的外泌體含有CD3分子[10]、心肌細胞來源的外泌體含肌節蛋白[11]、神經元分泌的外泌體含有谷氨酸受體等[12]。值得注意的是，外泌體還攜帶有如DNA、mRNAs、miRNAs等多種核酸分子，可與受體結合介導細胞內的信號調控，從而改變細胞功能。研究表明外泌體在血管生成、免疫抑制和癌癥等方面發揮著重要的作用[13-14]。除此之外，某些細胞分泌的外泌體還可用于疾病的治療，如間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源的外泌體(MSC-Exos)保留了其親本MSCs的特征，具有免疫調節、抑制炎癥反應及受損組織修復等功能[15-16]，可用于骨關節炎、特發性肺纖維化及眼科疾病等多種疾病的治療[17-19]。

1.2外泌體的免疫調節作用研究發現外泌體能有效激活或抑制機體的免疫應答，并可促進炎癥反應，參與腫瘤、自身免疫性疾病的發生與發展[2]。不同類型的細胞分泌的外泌體發揮的功能及作用也有差異。由T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞等免疫細胞分泌的外泌體具有免疫調節功能，可以影響天然免疫及獲得性免疫，參與抗原的提呈、T細胞的活化、免疫抑制及抗炎等過程[20-21]。值得注意的是，除免疫細胞外，非免疫細胞源性的外泌體也受到了越來越多人的關注。Poggio等[22]發現腫瘤細胞產生的外泌體可使細胞發生程序性死亡、阻止T細胞活化，從而促進腫瘤細胞的增長。此外，研究表明炎癥刺激可以使MSC-Exos分泌增加，從而增強了抗炎及免疫抑制的能力[23-25]。由此可見，外泌體的生物學功能與其細胞來源及微環境緊密相關，但其在IMED中的研究有待我們進一步深入挖掘與探討。

2外泌體參與免疫介導性眼病的發生發展

2.1外泌體與甲狀腺相關眼病TAO是一種危及視力且損傷外觀的特異性自身免疫性疾病，為Graves病(Graves’ disease,GD)的眼部臨床表現[26]。由于甲狀腺和眼周組織具有共同抗原，疾病狀態下免疫耐受平衡失調，可引起眼眶炎癥反應，導致眼肌纖維化、腫脹及局部脂肪增生，出現眼球突出及視神經受壓等臨床表現，嚴重影響患者的視力健康。目前，外泌體(或EVs)參與TAO的發生發展尚缺乏直接研究證據，但有研究表明外泌體與GD的發生發展密切相關。Hiratsuka等[27]研究發現，與健康對照組或GD緩解組患者相比，難治性GD組患者外周血單核細胞分泌的外泌體可使IL-1、TNF-α及IL-6表達增多，這提示了外泌體可能在GD的發病機制中發揮著重要的作用。此外，Edo等[28]研究表明，在正常和癌變的甲狀腺細胞系所分泌的外泌體中均存在甲狀腺刺激激素受體(thyroid stimulating hormone receptor,TSHR)，TSHR可與自身抗體結合發揮作用，從而減輕GD患者的癥狀。因此，我們有理由推測病損細胞分泌的外泌體涉及了TAO的發生與發展，但仍亟待進一步研究探索。

2.2外泌體與自身免疫性葡萄膜炎葡萄膜炎是發達國家致盲的主要原因之一[29]。AU為非感染性葡萄膜炎，該病可以單獨發生在眼部，如交感性眼炎、特發性葡萄膜炎等；也可以是全身系統性疾病的眼部表現，如全身性結節病、Behcet病及V-K-H綜合征等。目前，臨床上治療AU的方法主要包括糖皮質激素及免疫抑制劑，存在治療效果欠佳、全身及局部毒副作用大等問題[30-31]。有研究表明，AU的免疫反應主要由T淋巴細胞介導，為Th17細胞及其相關的炎性因子共同作用下完成的。Knickelbein等[32]研究發現，當葡萄膜炎累及到視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞時，可刺激RPE細胞分泌外泌體，抑制T淋巴細胞的增殖，從而阻止免疫反應的進一步發展。

2.3外泌體與角膜移植排斥反應角膜病是我國主要的致盲性眼病之一，角膜移植手術是治療角膜盲的主要方法。角膜作為無血管的透明組織，享有相對的免疫赦免特權。盡管如此，免疫排斥反應仍是導致角膜移植手術失敗的主要原因[33]。有研究表明，角膜移植排斥反應主要為同種異體排斥反應，移植后受體T細胞識別供體的主要組織相容復合物抗原而引發免疫應答[34-35]。研究表明，在角膜傷口愈合過程中小鼠角膜上皮細胞源性外泌體可誘導成纖維細胞增殖，并將角膜細胞轉化為成肌纖維細胞，從而介導角膜上皮和基質之間的細胞間通訊[36]。此外，Leszczynska等[37]研究發現人角膜緣基質細胞源性外泌體可顯著增強角膜緣上皮細胞的增殖并促進角膜傷口愈合，其作用機制可能是通過激活Akt信號通路實現的。總而言之，外泌體在角膜移植排斥中起到了重要的作用，為角膜損傷和移植排斥提供了新的診治思路。

2.4外泌體與Sj?gren綜合征SS是一種可累及多器官的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其主要累及唾液腺及淚腺，可引起口干、眼干等不適，嚴重影響患者的生活質量。SS的發病率約為1%，其中約90%患者為女性[38]。Kapsogeorgou等[39]研究發現，靜止的及活動的唾液腺上皮細胞所分泌的外泌體均含有Ro/SSA、La/SSB及Sm RNPs等自身抗原，并且RNPs在SS患者和健康者的外泌體中均顯著表達。此外，Michael等[40]首次成功地從唾液中分離并鑒定出攜帶miRNA的外泌體，提示檢測唾液外泌體的蛋白質和miRNA水平可能有助于SS的診斷，但我們需要更多的研究來評估唾液外泌體miRNA在SS診斷和預后中的價值。

2.5外泌體與年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration,ARMD)是一種與年齡相關的致盲性、退行性眼底病變，是導致老年人失明的主要原因[41]。ARMD可分為干性和濕性兩大類，其中干性ARMD占比約為80%，以黃斑區地圖狀萎縮及玻璃膜疣為特點；而濕性ARMD的特征主要為RPE層的功能退化及脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)的形成，CNV極易引起出血和滲出，影響患者視力。目前，ARMD的發病機制尚不完全清楚。有研究表明，ARMD的病理過程不僅與退化有關，還與免疫反應及炎癥反應有關[42]。Zhang等[43]研究發現在藍光的氧化刺激下，RPE衍生的外泌體可能通過上調NLRP3炎性小體來加劇氧化反應，從而加劇ARMD病程的發展。此外，補體系統在ARMD的發病過程中也起著十分重要的作用[44]。Wang等[45]研究發現在老化的視網膜中補體因子H功能異常，可使含有C3分子的RPE細胞源性外泌體遭受白細胞攻擊，導致外泌體膜不穩定及細胞內蛋白釋放，從而促進玻璃膜疣的形成；此外，該研究還發現CD63及CD8等外泌體標志物在ARMD中表達，而在健康對照組中不表達，這表明RPE細胞來源的外泌體在ARMD中與補體驅動的先天免疫反應有關。

3外泌體對免疫介導性眼病的治療潛力

外泌體不僅參與了IMED的病理生理過程，某些細胞來源的外泌體還對疾病有治療作用。外泌體的功能與其細胞來源緊密相關，其中研究最多的為MSC-Exos。MSCs為多功能干細胞，其分泌的外泌體具有免疫調節、抑制炎癥反應及受損組織修復等功能，可用于多種眼科疾病的治療。此外，眼部組織來源的細胞如RPE細胞、角膜上皮細胞等分泌的外泌體也可用于眼科疾病的治療。

Shigemoto-Kuroda等[46]發現人骨髓來源的MSC-Exos對AU的治療效果明顯，可顯著抑制T細胞增殖及Th1、Th17的發育。此外，Bai等[47]研究發現局部注射人臍帶來源的MSC-Exos可減輕白細胞浸潤并有效緩解大鼠葡萄膜炎的癥狀，其作用機制主要是通過抑制炎癥細胞遷移來發揮作用。值得一提的是，外泌體對角膜移植排斥也有一定的治療作用。賈喆等[48]發現MSC-Exos可以通過抑制CD4+細胞從而達到抑制角膜移植排斥的效果。Jangamreddy等[49]發現角膜上皮細胞來源的外泌體可以促進角膜組織的再生。除此之外，Han等[36]發現小鼠角膜上皮細胞來源的外泌體含有與傷口愈合和新生血管形成相關的蛋白質，包括血小板反應蛋白-2、轉化生長因子β結合蛋白1等，對角膜移植術后的傷口的愈合起到了重要作用。

在SS方面，Li等[50]研究發現結膜下注射MSC-Exos可明顯改善SS兔子的干眼癥狀、減輕淚腺的炎癥反應，考慮與淚腺巨噬細胞的極化調節作用及靶向NF-κB信號傳導增強了Treg和Th2的免疫應答有關。由此可見，MSC-Exos在無細胞療法治療SS干眼上有廣闊的應用前景。值得注意的是，外泌體對ARMD也有一定的治療效果。Aboul Naga等[51]研究發現貝伐單克隆抗體對ARMD的治療作用與外泌體有關，RPE細胞源性外泌體標志物CD63與貝伐單克隆抗體存在共定位現象，提示貝伐單克隆抗體存在于RPE源性外泌體中。此外，Hajrasouliha等[52]發現視網膜星形膠質細胞來源的外泌體可以同時攻擊巨噬細胞和血管內皮細胞，對激光誘導的視網膜血管滲漏和CNV具有明顯的抑制作用。總而言之，多種細胞來源的外泌體對多種IMED均有一定的治療作用。但是，外泌體是否可用于TAO的治療目前尚不明確，亟待進一步研究與探討。

4眼部疾病的外泌體生物標志物

近年來，研究發現某些細胞來源的外泌體及其攜帶的分子可作為生物標志物用于疾病的診斷及預測，尤其是在腫瘤方面[53]。有研究表明，對血清外泌體的表面蛋白進行檢測有助于癌癥的早期診斷及分類[54]。在眼睛方面，識別眼部體液中的外泌體生物標志物對眼部疾病的早期診斷具有重要的意義。Ragusa等[9]研究發現葡萄膜黑色素瘤患者的前房及血清的外泌體miR-146a表達明顯增高。因此，外泌體miR-146a可能為葡萄膜黑色素瘤的潛在標志物。Dismuke等[7]及Kang等[55]研究發現，房水中的外泌體及其攜帶的miRNA或蛋白質有望成為青光眼及新生血管性ARMD的診斷性生物標志物。除此之外，Ahn等[56]研究表明RPE細胞分泌的EVs miR-494-3p在非新生血管性ARMD的RPE線粒體損傷中發揮著重要的作用，有望成為ARMD的潛在生物標志物。總體而言，隨著外泌體特異性分離技術及其蛋白質和核酸定量檢測方法的不斷更新，外泌體作為眼部疾病特異性生物標志物的應用將越來越廣泛。

5總結與展望

綜上所述，外泌體作為一種由細胞分泌的脂質雙分子層囊泡，在細胞間通訊和免疫調節等方面起著重要的作用。一方面，病損細胞分泌的外泌體介導了IMED的發生與發展，這提示了外泌體作為IMED診斷或預后標志物的潛在價值。另一方面，MSCs等細胞來源的外泌體在IMED的治療上具有良好的應用前景，但目前存在的諸多應用困境(如外泌體的最佳細胞來源、輸注途徑、治療時機及劑量、外泌體與免疫抑制劑的協同治療等)有待攻克，其安全性及療效也有待更為深入的臨床前及臨床研究予以論證。我們相信，隨著研究思路和研究技術的不斷進步，外泌體與IMED的研究有望得到突破，并為IMED的診治提供新策略、開辟新路徑。