兩種程序在患兒靜態(tài)淋巴細(xì)胞采集中的應(yīng)用比較

張?jiān)旅?陳 娟,喬佳麗,尹晴雪

河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院血細(xì)胞分離室,河北廊坊 065200

細(xì)胞治療是指利用某些具有特定功能的細(xì)胞特性，采用生物工程方法獲得，或進(jìn)行體外擴(kuò)增、培養(yǎng)等處理后，使其具有增強(qiáng)免疫、殺滅病原體和腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)組織器官再生和機(jī)體康復(fù)等治療功效，從而達(dá)到治療疾病的目的[1]。近年來(lái)，通過血細(xì)胞分離機(jī)采集單個(gè)核細(xì)胞，為血液病及惡性腫瘤患者實(shí)施嵌合抗原受體T細(xì)胞(CART細(xì)胞)及細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞(CIK細(xì)胞)免疫治療，已成為治療血液病及惡性腫瘤的重要方法[2-3]。血細(xì)胞分離機(jī)-COBE光譜一直是細(xì)胞單采術(shù)的主力，它由一個(gè)微處理器控制，在這個(gè)微處理器中抗凝血液會(huì)進(jìn)入離心機(jī)，紅細(xì)胞被分離到離心帶外層，血漿在離心帶中間，離心帶另外兩層則是含有白細(xì)胞和血小板的白膜層，根據(jù)血液各成分的密度差異，利用梯度離心原理將全血分離成不同成分的層面，通過界面探測(cè)器識(shí)別不同成分的血細(xì)胞后進(jìn)行對(duì)應(yīng)層面的提取[4]。COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)的全自動(dòng)采集程序(AutoPBSC程序)和半自動(dòng)采集程序(MNC程序)均可提取單個(gè)核細(xì)胞，未動(dòng)員的淋巴細(xì)胞可根據(jù)臨床需要培養(yǎng)成為CART細(xì)胞或CIK細(xì)胞。本研究通過比較采集相關(guān)指標(biāo)和采集物中淋巴細(xì)胞數(shù)量，探討AutoPBSC程序與MNC程序在靜態(tài)淋巴細(xì)胞采集中的應(yīng)用效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2018年2月至2020年2月總血容量(TBV)為1 100～1 893 mL的患兒70例作為研究對(duì)象，其中男41例，女29例，隨機(jī)分為AutoPBSC組(34例)和MNC組(36例)。AutoPBSC組患兒年齡1～10歲，平均(7.82±1.21)歲，TBV中位數(shù)為1 368.51 mL，不采用紅細(xì)胞預(yù)注管路。MNC組患兒年齡2～7歲，平均(5.41±0.85)歲，TBV中位數(shù)1 501.02 mL，均采用紅細(xì)胞預(yù)注管路。采集通路為外周靜脈穿刺30例，股靜脈置管40例。兩組患兒年齡、采集前白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、TBV、血細(xì)胞比容(HCT)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性，見表1。

表1 兩組患兒一般資料比較

1.2儀器與試劑 患兒采集前血常規(guī)采用貝克曼庫(kù)爾特UniCel DxH800血細(xì)胞分析儀，采集物WBC和采集物淋巴細(xì)胞百分比采用邁瑞B(yǎng)C-2600全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，抗凝劑為山東威高集團(tuán)醫(yī)用高分子制品股份有限公司生產(chǎn)的血液保存液(Ⅰ)，為復(fù)方制劑，其1 000 mL的主要組分為：枸櫞酸鈉22.0 g、枸櫞酸8.0 g、葡萄糖24.5 g。

1.3方法 (1)AutoPBSC程序靜態(tài)淋巴細(xì)胞采集方法：使用6.1版軟件的COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)和雙級(jí)充填盤,按照采集液流徑指示膜安裝AutoPBSC管路，初始化后輸入患兒身高、體質(zhì)量、HCT、WBC 、單個(gè)核細(xì)胞(MNC)%,設(shè)定循環(huán)血量為患兒2～3倍TBV,全血流速15～40 mL，收獲量3 mL,追趕量7 mL,設(shè)定每500毫升收獲1次，采集物終體積=(收獲量+追趕量)×收獲次數(shù)。(2)MNC程序靜態(tài)淋巴細(xì)胞采集方法：選用單級(jí)充填盤，基本步驟同AutoPBSC程序，初始化后輸入患者身高、體質(zhì)量、HCT,設(shè)定循環(huán)血量為患兒2～3倍TBV,全血流速15～40 mL，MNC程序在采集界面建立時(shí)需要操作人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，通過目測(cè)比色法手控調(diào)節(jié)血漿泵流速進(jìn)行淋巴細(xì)胞采集,采集物終體積為采集界面建立后至總循環(huán)血量結(jié)束對(duì)應(yīng)的毫升數(shù)，為70～100 mL。(3)紅細(xì)胞預(yù)注管路方法：由雙人對(duì)紅細(xì)胞懸液進(jìn)行“四查十對(duì)”，保證輸血安全；遵醫(yī)囑在輸注紅細(xì)胞前給予抗過敏藥物；反向識(shí)別患兒及血型，采血端連接一次性輸血器及三通道旋閥，為患兒慢速輸注10 min，觀察有無(wú)過敏反應(yīng)。旋轉(zhuǎn)三通閥關(guān)閉通道，開放機(jī)器與輸血器通道，打開采血端白色卡子，并全部打開輸血器滾動(dòng)閥，運(yùn)行機(jī)器，將抗凝劑與全血比例調(diào)至1∶50，速度調(diào)至30～50 mL/min,此時(shí)紅細(xì)胞快速填充管路，將生理鹽水排至廢液袋，機(jī)器顯示“Close return saline.Press CLEAR(關(guān)閉回輸端鹽水，請(qǐng)按清除鍵)”時(shí)，關(guān)閉回輸端鹽水滾動(dòng)閥，按清除鍵后再按“暫停/繼續(xù)”鍵，此時(shí)關(guān)閉采血端白色卡子，關(guān)閉輸血器滾動(dòng)閥，卸下三通旋閥，將采血端管路與采血通道連接并打開關(guān)卡，繼續(xù)運(yùn)行機(jī)器，根據(jù)患兒自身血小板設(shè)定抗凝劑與全血比例。此時(shí)開始采集患兒全血，機(jī)器顯示快速建立界面。(4)靜脈通路：COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)中AutoPBSC程序和MNC程序采用雙針式管路，需建立2條靜脈通路，一般選用外周肘部靜脈，采血端使用一次性17G采血針或18G留置針，回輸端使用 20～22G靜脈留置針;外周血管穿刺困難者，給予股靜脈置入7F或8F中心靜脈血管，采集完成后拔除。

2 結(jié) 果

2.1兩組患兒采集情況比較 AutoPBSC組患兒循環(huán)量、采集時(shí)間均高于MNC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MNC組患兒采集量高于AutoPBSC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患兒采集情況比較

2.2兩組患兒采集物比較 AutoPBSC組患兒采集物WBC高于MNC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組患兒采集物淋巴細(xì)胞百分比、采集物淋巴細(xì)胞數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組患兒采集物比較

3 討 論

CART-19 細(xì)胞療法的出現(xiàn)給血液惡性腫瘤患者帶來(lái)了更多的生存希望，該療法在急性淋巴細(xì)胞白血病等早期臨床試驗(yàn)中成效明顯[5]。細(xì)胞因子CIK細(xì)胞是一種效應(yīng)細(xì)胞，從技術(shù)和方法學(xué)角度看，它們?cè)隗w外很容易擴(kuò)張，而且安全，并且對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤顯示出有效性。CIK細(xì)胞對(duì)廣泛的腫瘤組織類型發(fā)揮細(xì)胞毒性，但對(duì)正常組織和造血前體細(xì)胞不起作用。成功采集淋巴細(xì)胞是培養(yǎng)CART細(xì)胞和CIK細(xì)胞的關(guān)鍵。CART細(xì)胞回輸后橋接造血干細(xì)胞移植(HSCT)，對(duì)于HSCT 患者而言，有效紅細(xì)胞輸注可延長(zhǎng)輸注紅細(xì)胞在體內(nèi)的存活時(shí)間，延長(zhǎng)患者輸注紅細(xì)胞的時(shí)間間隔，降低異體紅細(xì)胞輸血量，避免機(jī)體接收過多的外來(lái)血型抗原刺激，降低同種異體抗體發(fā)生比例[6]。有研究證實(shí)，不同劑量的成分輸血可改變急性白血病患兒的免疫功能，使患兒產(chǎn)生不同程度的免疫抑制，尤其以大劑量成分輸血對(duì)患兒的免疫抑制作用影響更為明顯[7]。COBE Spectra血細(xì)胞分離機(jī)操作手冊(cè)要求，系統(tǒng)的體外環(huán)路容量超過患兒TBV的10%～15%時(shí)，為維持患兒的血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性，需用一個(gè)單位與患兒相容的紅細(xì)胞沖潤(rùn)體外環(huán)路。MNC程序的管路存留的體外環(huán)路容量為285 mL，其中所需紅細(xì)胞量為114 mL，等于TBV的10%時(shí)，如果患兒TBV等于或小于2 840 mL時(shí)，需實(shí)施紅細(xì)胞預(yù)注，等于TBV的15%時(shí)，如果條件是患兒TBV等于或小于1 893 mL時(shí)，需實(shí)施紅細(xì)胞預(yù)注。AutoPBSC程序的管路體外環(huán)路容量為165 mL，其中所需紅細(xì)胞量為66 mL，等于TBV的10%時(shí)，如果條件是患兒TBV等于或小于1 650 mL時(shí)，需實(shí)施紅細(xì)胞預(yù)注，等于TBV的15%時(shí)，如果條件是患兒TBV等于或小于1 100 mL時(shí)，需實(shí)施紅細(xì)胞預(yù)注。患兒體質(zhì)量輕、血容量較少，對(duì)血容量改變的反應(yīng)較成人更明顯，采集前用紅細(xì)胞預(yù)注管路，可避免發(fā)生低血容量不良反應(yīng)[8]。AutoPBSC程序體外循環(huán)血量少，故適合于兒童患者。如患者呈貧血狀態(tài)，管路所需紅細(xì)胞量占全血紅細(xì)胞總?cè)萘砍^15%，不論哪種程序，都需進(jìn)行紅細(xì)胞預(yù)注，以保證血流的穩(wěn)定性。對(duì)于重度貧血患者，采集前用紅細(xì)胞預(yù)注管路可減少管路占用紅細(xì)胞帶來(lái)的不適。

本研究探討了TBV在1 100～1 893 mL時(shí)，選用MNC程序在采集靜態(tài)淋巴細(xì)胞前進(jìn)行紅細(xì)胞預(yù)注，選用AutoPBSC程序在采集靜態(tài)淋巴細(xì)胞前可不進(jìn)行紅細(xì)胞預(yù)注，其采集產(chǎn)品中淋巴細(xì)胞數(shù)無(wú)差別，為臨床醫(yī)生提供了參考依據(jù)。目前仍處于新型冠狀病毒疫情期間，各地血源緊張，AutoPBSC程序和MNC程序收獲的采集效果相同，應(yīng)用AutoPBSC程序采集靜態(tài)淋巴細(xì)胞，節(jié)省血源，可減少輸血相關(guān)感染的風(fēng)險(xiǎn)，減少輸血過敏反應(yīng)及輸血帶來(lái)的不良反應(yīng)，把緊缺的血留給更需要的患者。兒童采集不同于成人，理想狀況下，取患兒的肘前靜脈進(jìn)行穿刺作為采血端，對(duì)側(cè)穿刺腕部或肘部作為回輸端。然而，幼兒外周靜脈常無(wú)法實(shí)現(xiàn)上述操作。大多數(shù)情況下需要建立中心靜脈通路，即由醫(yī)生在深靜脈內(nèi)放置中心靜脈導(dǎo)管。股靜脈置管采集中，所置管路為雙腔，進(jìn)血管路連接側(cè)孔，收集患者全血，回輸管路連接端孔，以避免局部渦流形成的內(nèi)循環(huán)，影響采集效果。如側(cè)孔出血不暢，可將進(jìn)血管路連接端孔，另選擇外周靜脈建立回路。在MNC程序中，如遇到輸入壓力不穩(wěn)，反復(fù)報(bào)警情況時(shí)，采集界面不穩(wěn)定，可影響采集效果。MNC程序采集過程中，離心艙收集管斷斷續(xù)續(xù)，白膜層收集尾部顏色以略帶粉紅色為宜，如收集的白膜層尾部顏色很淺，表明MNC收集不夠，宜將血漿泵參數(shù)調(diào)高；如收集的白膜層尾部顏色偏紅，則表明產(chǎn)品中混入紅細(xì)胞過多，宜將血漿泵參數(shù)調(diào)低。因此，程序參數(shù)的調(diào)節(jié)是一把雙刃劍，單位處理血量中主產(chǎn)品得率的提高意味著其他細(xì)胞的混入率增加，若提高主產(chǎn)品的純度則會(huì)降低主產(chǎn)品的得率[9]。AutoPBSC程序?yàn)槿詣?dòng)程序，對(duì)血流速度的要求相對(duì)MNC程序低，對(duì)采集操作者的要求低，采集界面更穩(wěn)定。BURGSTALER等[10]嘗試用不同的程序及設(shè)置以比較主產(chǎn)品的收集情況。AutoPBSC程序在采集時(shí)間方面較MNV程序增加，工作人員需監(jiān)測(cè)抗凝劑枸櫞酸鈉引起的不良反應(yīng)，采集過程中應(yīng)用預(yù)防性補(bǔ)鈣方法，采集過程中對(duì)患兒實(shí)施心電監(jiān)測(cè)、血氧飽和度監(jiān)測(cè)，采取預(yù)防性補(bǔ)鈣，采集前口服葡萄糖酸鈣溶液20 mL，采集過程中每小時(shí)口服葡萄糖酸鈣溶液10～20 mL，可減少低鈣反應(yīng)。

總之，對(duì)于低體質(zhì)量患兒，AutoPBSC程序更好，采集效果好，不需紅細(xì)胞預(yù)充，對(duì)采集技術(shù)要求低。應(yīng)為患兒提供優(yōu)質(zhì)的護(hù)理服務(wù)，包括采集前、采集中、采集后的護(hù)理，做好充分的心理護(hù)理和健康宣教，取得患兒的信任和配合，減輕其身體不適，從而保證采集工作順利開展。