外泌體miRNA及其作為腫瘤分子標志物的研究進展*

劉 念 綜述,張國軍，姚群峰 審校

湖北中醫藥大學檢驗學院，湖北武漢430065

惡性腫瘤是對人類健康威脅最大的一類疾病，其發病率和病死率呈逐年上升趨勢。惡性腫瘤的早期診斷對于臨床精準治療和預后轉歸有重要意義。液體活檢是一種方便、快速、無創、可多次取樣的檢測方法，可以動態反映腫瘤基因表達模式的變化,在腫瘤早期診斷及臨床治療中發揮越來越重要的作用。液體活檢主要是通過檢測血液等體液中的循環腫瘤細胞、游離DNA、循環腫瘤DNA、小分子RNA、外泌體等生物分子，分析評估患者體內腫瘤發生、發展、變化等相關情況，用于腫瘤診斷及輔助治療等。不同細胞來源的外泌體及其內容物(蛋白質、核酸、糖結合物和脂質等)蘊含豐富的生物學信息，特別是外泌體miRNA與腫瘤發生和發展的關系已引起人們的高度關注，外泌體miRNA有望成為惡性腫瘤早期診斷和預后判斷的生物標志物[1-2]。

1 外泌體miRNA

外泌體是一種細胞來源的納米級的細胞外囊泡，可以通過掃描電子顯微鏡、透射電子顯微鏡等方式觀察其形態，用納米粒子跟蹤分析測量其大小和水平。外泌體可以由許多類型的細胞主動分泌，例如紅細胞、內皮細胞、神經細胞、樹突狀細胞和腫瘤細胞等[3]。在血液、尿液、胸腔積液、唾液、支氣管肺泡灌洗液和羊水等體液中都存在大量外泌體[4]。來源不同的外泌體內含物成分不盡相同，但大都含有核酸、蛋白質、脂質等，在細胞間信號通訊中發揮重要作用。miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的小單鏈RNA，它可以通過與靶mRNA的3′-非翻譯區或開放閱讀框區域結合而介導轉錄后基因沉默，在細胞增殖、分化、遷移及疾病發生和發展等過程中發揮重要調控作用[5-6]。miRNA不僅存在于血液、唾液、尿液中，外泌體中也含有miRNA。外泌體miRNA因其被磷脂雙分子層保護免受RNase的降解，有利于外泌體miRNA的分離提取和儲存。當外泌體循環時，外泌體中的miRNA可以被鄰近或遠處的細胞吸收并調節受體細胞發揮相應的作用，通過循環囊泡傳遞細胞間信息被認為是信號轉導的第3條途徑[7]。外泌體miRNA與許多腫瘤(包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肝癌、胰腺癌、膽管癌和前列腺癌等)的發生、發展及預后關系密切。

2 外泌體miRNA在腫瘤分子診斷中的臨床意義

外泌體miRNA具有廣泛的生物學效應，它在腫瘤早期篩查、早期診斷、臨床治療和預后等方面的潛在應用價值引起人們的高度關注。對于相同的細胞或組織，病理狀態下的外泌體水平遠遠高于正常生理狀態下的外泌體水平，腫瘤細胞來源外泌體的種類和水平與正常細胞也存在明顯差異，體液中的外泌體miRNA在腫瘤源性細胞中也有各自的特異性表達。外泌體miRNA與肝細胞癌(HCC)[8]、胰腺癌[9]、乳腺癌[10]等惡性腫瘤的相關性研究都顯示外泌體miRNA與腫瘤的發生、發展、臨床分型及早期診斷等密切相關，具有十分重要的臨床意義，被認為是一種具有廣闊前景的腫瘤生物標志物。

2.1外泌體miRNA與肺癌 外泌體miRNA可以用于肺癌的早期診斷和預后評估。JIN等[11]分別檢測分析了Ⅰ期非小細胞肺癌(NSCLC)患者和健康個體的血漿外泌體miRNA表達情況，結果顯示，肺腺癌特異性表達miR-30e-3p、miR-30a-3、miR-181-5p和miR-361-5p，而肺鱗癌特異性表達miR-10b-5p、miR-320b和miR-15b-5p。相比健康個體，肺癌患者外泌體miR-181b-5p、 miR-10b-5p、miR-361b-5p和miR-320b 的表達存在明顯差異(P<0.05)。此外，腫瘤細胞外泌體miRNA還與NSCLC病理分型密切相關。LIU等[12]通過定量聚合酶鏈反應(qPCR)檢測分析了10例肺癌患者和10例健康對照者的84種血漿外泌體miRNA，根據其報道和qPCR檢測顯示異常表達的外泌體miRNA中選擇了9種候選miRNA，以進一步評估其在196例NSCLC患者中的預后作用，通過對患者進行隨訪和研究分析顯示，外泌體miR-23b-3p、miR-10b-5p和miR-21-5p水平升高與總體生存不良有關(P<0.05)，與臨床預后變量模型比較時，上述3種外泌體miRNA明顯提高了生存預測準確性，結果表明這些外泌體miRNA可以用作肺癌預后生物標志物。劉玉山等[13]同時對NSCLC、肺炎和健康體檢者中外泌體miRNA-184的表達情況進行比較，NSCLC患者血清外泌體miRNA-184表達水平明顯高于肺炎患者和健康體檢者，差異均有統計學意義(P<0.05)，高水平miRNA-184對于NSCLC的臨床診斷效能較高。

2.2外泌體miRNA與肝癌 SOHN等[8]研究了血清外泌體miRNA作為HCC生物標志物的可行性，采用實時熒光定量PCR對慢性乙型肝炎(CHB)、肝硬化(LC)和HCC患者的血清外泌體miRNA表達水平進行檢測，HCC患者血清外泌體miR-18a、miR-221、miR-222和miR-224水平明顯高于CHB和LC患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。HCC患者血清外泌體miR-101、miR-106b、miR-122和miR-195水平低于CHB患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。BASU等[14]研究發現，外泌體miRNA的傳遞是HCC細胞間信息交流的一種重要方式，miR-122是肝臟特異性miRNA，它通過外泌體在Huh7細胞和HepG2細胞這兩種肝癌細胞間傳輸，這兩種具有不同miR-122表達譜的肝癌細胞之間存在相互作用。

2.3外泌體miRNA與消化道腫瘤 MIN等[15]從已報道的結直腸癌標志物中選擇了4種外泌體miRNA，包括let-7b-3p、miR-139-3、miR-145-3p和miR-150-3p，分別進行受試者工作特征曲線分析并計算曲線下面積(AUC)，研究其表達水平差異，AUC值分別為0.792、0.686、0.692、0.679，AUC值均大于0.5,證明其可以對早期結直腸癌患者和具有各種胃腸道癥狀的非癌變對照者進行較好地區分，對于診斷結直腸癌有一定價值。與選用單個外泌體miRNA生物標志物相比，選擇多種miRNA的組合可獲得更高的對早期結直腸癌患者的診斷特異度[16]，let-7b-3p和miR-145-3p組合的AUC為0.901，miR-139-3p、miR-145-3p和let-7b-3p組合的AUC為0.927。MADHAVAN等[17]研究報道了胰腺癌患者血清外泌體miRNA水平，相比健康對照組和非惡性疾病患者，83%的胰腺癌患者血清外泌體miR-1246、miR-4306和miR-4644水平明顯上升，差異均有統計學意義(P<0.05)，提示胰腺腫瘤細胞來源的外泌體miRNA水平上升有助于胰腺癌的臨床診斷。

2.4外泌體miRNA與其他腫瘤 MENG等[18]測定了上皮來源的卵巢癌患者血清外泌體miRNA，發現卵巢癌患者血清外泌體miR-375、miR-200a、miR-200b和miR-200c表達水平明顯高于健康女性，且miR-200a、miR-200b和miR-200c的表達水平與腫瘤的惡性程度相關。血清外泌體miRNA和血清標志物糖類抗原125聯合應用可明顯提高卵巢癌診斷的特異度和準確度。膠質母細胞瘤(GBM)來源的外泌體miRNA的表達譜與正常組織細胞存在較大差異。MANTEROLA等[19]研究發現，外泌體miR-320和miR574-3p組合可以將GBM患者與健康個體區分，聯合應用可作為診斷GBM的生物標志物。此外，GBM不同的亞型也表現出不同的外泌體miRNA表達譜，外泌體及其miRNA被認為是GBM分子分型的調節者。在前列腺癌患者中外泌體miR-182和miR-183呈高表達[20]，而外泌體miR-375和miR-1290可用于前列腺癌患者的預后評估[21]。

3 外泌體miRNA分離富集與檢測

3.1外泌體分離富集 不同的標本類型和研究目的應選擇不同的外泌體分離富集方法，超速離心是使用最廣泛的外泌體提取方法，但存在所需樣品量大、處理時間長和雜質較多等缺點[22]；商業化試劑盒法所需時間較短且可在低離心力下分離，但對外泌體缺乏特異性；聚乙二醇(PEG)共沉淀方法是在4 ℃用PEG孵育樣品過夜，然后低速離心分離，可快速分離富集外泌體，但存在外泌體純度和回收率低的問題。通過免疫磁珠法獲得外泌體后，直接用裂解液處理可得到其中的miRNA，該方法提取的外泌體特異度和純度均較高，且不影響外泌體的結構，但其不適合在大量樣本中獲取外泌體，且價格昂貴，難以保存。

3.2外泌體miRNA檢測 目前，外泌體miRNA檢測最常用的方法還是反轉錄聚合酶鏈反應(RT-qPCR)，RT-qPCR靈敏度較高，特異度較好，方法成熟，被認為是miRNA檢測的“金標準”。微陣列芯片法可以實現miRNA的高通量測定，更適合用于比較不同的細胞狀態之間miRNA的表達水平，但其檢測范圍較小[23]。此外，近年來基于電化學的納米生物傳感技術越來越多地應用于miRNA的檢測。LIU等[24]使用肽核酸和球形核酸協同的“三明治”結構的電化學傳感器檢測外泌體miRNA，具有高靈敏度和高特異度，能準確進行免疫標記且不依賴酶的miRNA檢測。MAJD等[25]利用二硫化鉬來修飾場效應晶體管(FET)，構建的FET生物傳感器可實現免疫標記超敏感檢測miRNA-155。RAMSHANI 等[26]將基于表面聲波外泌體裂解微流體芯片與濃縮傳感微芯片集成在一起，構建微流控平臺來檢測miRNA，這種新的集成系統不需要預處理或分析物轉移，并且縮短了測定時間，此類微芯片系統通過利用高性能材料構建納米生物傳感平臺，并通過多重信號放大，可以實現外泌體miRNA快速、靈敏和特異性檢測，具有廣闊的應用前景。

4 展 望

綜上所述，外泌體miRNA與腫瘤的發生、發展、臨床分型及早期診斷等均有十分緊密的關系，而且在腫瘤生長過程中外泌體會不斷釋放到外周環境中去，因此，可以通過檢測體液中外泌體miRNA用于腫瘤的早期診斷、臨床治療和預后判斷。相比其他腫瘤早期診斷指標及檢測方法，外泌體miRNA作為腫瘤生物標志物有以下優勢：(1)體液樣品比較容易獲得，液體活檢取材方便，能夠減少取材風險；(2)由于外泌體膜能保護miRNA免受RNA酶的影響，因此外泌體miRNA比血漿miRNA更穩定；(3)與血漿miRNA相比，外泌體包含更高水平的miRNA，如let-7、miR-1、miR-181和miR-375等，更易于檢測。目前，有關外泌體miRNA在腫瘤的診斷與治療中的應用還有待更進一步的深入研究。一方面是還需要開展大樣本量的基礎研究，提高目標miRNA與不同類型腫瘤之間的特異度，特別是需要構建不同的外泌體miRNA組合與特定腫瘤的相關性表達譜[27-28]；其次還需要深入研究不同種類的miRNA與腫瘤不同發展轉化階段的相關性，篩選出真正的具有早期診斷意義的miRNA；此外，還需要進一步完善外泌體miRNA的檢測方法，特別是需要發展建立操作簡便、快速靈敏、重現性好的、新的外泌體miRNA檢測方法，這將有助于推動外泌體miRNA的臨床應用[29]。