氧化型低密度脂蛋白和核因子-κB在頸動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用*

劉首明，江小萍，沈祖泓，劉冰冰，朱少琴，柳 健

廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2.老干部保健科；3.科教部；4.功能科,廣東清遠(yuǎn) 511500

我國(guó)因動(dòng)脈粥樣硬化(AS)引起的急性心腦血管疾病形勢(shì)越來(lái)越嚴(yán)峻，頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(CIMT)增加和形成斑塊的不穩(wěn)定性是心腦血管疾病發(fā)病的重要生理、病理基礎(chǔ)[1]。大量研究證實(shí),AS是多種免疫因素和炎癥因子參與的慢性炎性疾病[2-3]；AS以機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞受損、功能障礙為起始，繼而血脂侵入內(nèi)皮組織下，引起單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜下增殖并吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，分泌多種促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致動(dòng)脈內(nèi)膜增厚、纖維化和粥樣斑塊形成。有文獻(xiàn)報(bào)道，AS發(fā)病機(jī)制涉及炎性反應(yīng)、脂質(zhì)代謝失調(diào)及氧化應(yīng)激等多種病理生理機(jī)制[4]。因此，從AS炎癥信號(hào)通路角度研究干預(yù)AS病變過(guò)程具有重要意義。低密度脂蛋白(LDL)是導(dǎo)致AS的主要危險(xiǎn)因素，可引起血管壁損傷、血管內(nèi)皮通透性增強(qiáng)并大量釋放氧自由基[5]，可氧化循環(huán)中的LDL修飾成為氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)，并聚集于內(nèi)皮細(xì)胞下，具有強(qiáng)烈的致AS作用，并成為AS研究的熱點(diǎn)之一。核因子-κB(NF-κB)是一種具有多項(xiàng)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，存在于心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中，參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究旨在證實(shí)oxLDL水平和AS NF-κB p65表達(dá)水平在中西結(jié)合用藥的情況下對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化及斑塊的影響及相關(guān)性，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2018年12月本院心血管科收治的符合AS診斷標(biāo)準(zhǔn)的111例患者作為研究對(duì)象，其中男65例，女46例，平均年齡(66.50±14.24)歲。所有入選者均知情同意并簽署知情同意書(shū)，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《中國(guó)成人血脂異常防治指南》[6]的診斷標(biāo)準(zhǔn)，血脂異常、CIMT≥ 0.9 mm或(和)有頸動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的患者；排除標(biāo)準(zhǔn)，已知或在隨訪期間患嚴(yán)重肝腎疾病、腫瘤、惡病質(zhì)等患者。將111例患者隨機(jī)分成氟伐他汀組37例，男21例，女16例，平均年齡(65.86±13.86)歲；三七總皂苷組36例，男21例，女15例，平均年齡(66.28±12.59)歲；中西醫(yī)結(jié)合組38例，男23例，女15例，平均年齡(67.32±12.29)歲。根據(jù)是否有斑塊形成，又將患者分為非斑塊組66例，男37例，女29例，平均年齡(65.73±14.24)歲;斑塊組45例，男28例，女17例，平均年齡(67.02±12.33)歲。3組患者性別、年齡等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2治療方法 入選患者均進(jìn)行常規(guī)治療，AS治療方法分為氟伐他汀組口服氟伐他汀鈉40 mg，1次/天；三七總皂苷組口服三七總皂苷(血塞通)100 mg，3次/天；中西醫(yī)結(jié)合組同時(shí)口服以上兩種藥物，用法與前兩組一致。治療周期均為12周。三七總皂苷(血塞通)批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20040016，氟伐他汀鈉批號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20010518[7]。停用氟伐他汀警戒值[6]：服藥期間出現(xiàn)肌肉疼痛癥狀，且血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)或天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)達(dá)到正常高限3倍及合并總膽紅素升高、肌酸激酶(CK)達(dá)到正常高限5 倍、肌酐為221 mmoL/L等嚴(yán)重不良反應(yīng)，應(yīng)減少用藥劑量或停藥。

1.3血清標(biāo)本收集及檢測(cè) 患者入組后記錄其年齡、性別、體質(zhì)量、病史情況等，采集標(biāo)本前72 h禁止飲酒及高脂飲食。入院后于用藥前和用藥治療12周后分別采集空腹靜脈血5～10 mL[7]，以3 000 r/min離心10 min 分離血清。血清oxLDL水平檢測(cè)采用雙抗體夾心 ELISA，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供，所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照儀器及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取 取抗凝血約 6 mL，加入等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋?zhuān)偌? mL淋巴分離液；血樣、PBS、分離液體積比為1∶1∶1。3 000 r/min離心25 min，吸出血漿層與分離液層之間的白色膜狀物；并加入相同體積的PBS，混勻，1 500 r/min離心10 min；重復(fù)洗滌3次，即為提取的PBMC[8]。

1.5NF-κB p65表達(dá)測(cè)定 采用免疫組織化學(xué)法對(duì)NF-κB進(jìn)行檢測(cè)：對(duì)分離出的PBMC利用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，選擇鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體，稀釋比例1∶200，利用瑞氏染色法檢測(cè)活細(xì)胞比例[8]。采用Olympus顯微鏡(400倍)進(jìn)行觀察并采集圖像，按染色結(jié)果判定陽(yáng)性細(xì)胞百分率為NF-κB p65的表達(dá)水平。NF-κB p65抗體試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，所有檢測(cè)均嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.6頸動(dòng)脈超聲檢查 采用美國(guó)通用GEV7超聲診斷儀進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查，周?chē)芴筋^頻率為7.5～10.0 MHz，于治療前后分別測(cè)量左右兩側(cè)頸總動(dòng)脈，頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈和頸動(dòng)脈分叉處 CIMT及斑塊[9-10]。CIMT<0.9 mm 為內(nèi)膜中層厚度正常，0.9 mm≤CIMT<1.2 mm 為內(nèi)膜中層增厚，以?xún)?nèi)膜局限性突出管腔、內(nèi)膜厚度≥1.2 mm 為斑塊形成。

1.7觀察用藥后反應(yīng) 觀察肝腎功能、胃腸道反應(yīng)、出血情況及其他不良反應(yīng)。

2 結(jié) 果

2.13組患者用藥前后CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較 用藥前3組患者CIMT、oxLDL、NF-κB p65水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；用藥12周后與用藥前比較，3組患者CIMT、oxLDL、NF-κB p65水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；用藥12周后，中西醫(yī)結(jié)合組患者與氟伐他汀組、三七總皂苷組比較，oxLDL、NF-κB p65水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組患者用藥前后CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較

2.2斑塊組與非斑塊組患者CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較 用藥前和用藥12周后,斑塊組患者CIMT、oxLDL和NF-κB p65水平均明顯高于非斑塊組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 斑塊組與非斑塊組患者CIMT、oxLDL和 NF-κB p65水平比較

2.3血清oxLDL水平與CIMT的相關(guān)性分析 血清oxLDL水平、PBMC中NF-κB p65水平與CIMT增厚及斑塊性質(zhì)均呈明顯正相關(guān)(r=0.599、0.410，P<0.05)；且血清oxLDL水平與PBMC中NF-κB p65水平呈明顯正相關(guān)(r=0.636，P<0.05)。

2.43組患者用藥后不良反應(yīng)發(fā)生率比較 氟伐他汀組、三七總皂苷組、中西醫(yī)結(jié)合組患者用藥過(guò)程中肝腎功能、胃腸道反應(yīng)、出血情況及其他不良反應(yīng)發(fā)生率分別為2.70%、2.77%、2.63%，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

有研究認(rèn)為，AS是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程，實(shí)質(zhì)是細(xì)胞介導(dǎo)的多種因素共同參與的慢性炎性反應(yīng)，與重要臟器損害存在關(guān)聯(lián)，并且決定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[11]。在整個(gè)疾病發(fā)展的過(guò)程中內(nèi)皮功能受損是最早期改變，由于血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷或功能失調(diào)，導(dǎo)致血管活性物質(zhì)分泌與釋放紊亂，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞抗血栓能力降低，并表達(dá)大量的細(xì)胞黏附因子，促進(jìn)血管內(nèi)炎性反應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致粥樣斑塊與血栓形成。因此，血管內(nèi)皮功能評(píng)價(jià)已經(jīng)作為一種重要的診斷和研究方法應(yīng)用于臨床[12]。

oxLDL導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙，細(xì)胞內(nèi)大量膽固醇匯集，進(jìn)而形成單核巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，大量泡沫細(xì)胞停留在血管壁內(nèi)，導(dǎo)致炎性反應(yīng)發(fā)生，使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊得以形成，從而累及AS的各個(gè)階段，亦影響不穩(wěn)定及易損斑塊發(fā)生、演變及破裂。oxLDL作為AS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，是參與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要循環(huán)生物標(biāo)志物。降低循環(huán)中oxLDL水平，是抗AS及預(yù)防其并發(fā)癥的一條途徑[13]。

NF-κB是一種重要的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，廣泛參與炎癥介質(zhì)、黏附分子和趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶等基因的調(diào)控，在機(jī)體非特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。NF-κB抑制蛋白通過(guò)調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路的活動(dòng)，參與內(nèi)皮細(xì)胞的活化和炎癥因子的表達(dá)，在AS的形成、發(fā)展過(guò)程中影響極深。許多NF-κB 誘導(dǎo)物和受調(diào)解的基因直接或間接涉及AS，發(fā)揮抗AS作用，因此，發(fā)現(xiàn)特異性的NF-κB 通路抑制劑可能是抗AS、抗炎和抗細(xì)胞凋亡的新治療途徑[14]。

ox-LDL對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響及作用機(jī)制目前尚無(wú)定論。有文獻(xiàn)報(bào)道,ox-LDL可激活NF-κB信號(hào)通路，從而使p65/p50從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)核蛋白中p65/p50的表達(dá)隨ox-LDL誘導(dǎo)水平增高和誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，由此證明ox-LDL激活NF-κB信號(hào)通路存在濃度和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。ox-LDL和NF-κB相互作用在AS斑塊的形成、發(fā)展及破裂過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

本研究以AS患者血清ox-LDL水平和PBMC中NF-κB p65水平在氟伐他汀和三七總皂苷治療前后的變化來(lái)證實(shí)其對(duì)頸動(dòng)脈粥樣硬化的影響，為臨床研究提供新的思路和方法。結(jié)果顯示，不論是單獨(dú)用藥還是中西醫(yī)結(jié)合治療AS，與用藥前比較，各組患者oxLDL、NF-κB p65水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中西醫(yī)結(jié)合組治療后oxLDL、NF-κB p65水平與其他兩組比較均明顯降低，說(shuō)明氟伐他汀和三七總皂苷均可有效降低oxLDL、NF-κB p65的表達(dá)。氟伐他汀和三七總皂苷均具有抗血栓、降血脂、抑制血小板聚集、減輕炎性反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮的功能，以及抑制頸動(dòng)脈內(nèi)膜增厚及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。本研究證實(shí)，血清oxLDL水平、PBMC中NF-κB p65水平與CIMT增厚及斑塊性質(zhì)呈明顯正相關(guān)，均參與了AS疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，可作為評(píng)估動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成情況有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。

綜上所述 ，血清ox-LDL可激活NF-κB 信號(hào)通路，并且ox-LDL水平越高，其激活NF-κB 信號(hào)通路的能力越強(qiáng)，對(duì)其干預(yù)治療AS作用機(jī)制的研究，為中醫(yī)藥治療AS提供了更多思路。血清ox-LDL及PBMC中NF-κB p65水平有助于早期診斷和預(yù)防AS， 對(duì)其嚴(yán)重程度及其預(yù)后也能進(jìn)行評(píng)估。