維生素D在NOD.H-2h4小鼠實驗性自身免疫性甲狀腺炎中的作用研究*

柯文才，毛會軍，顧蕓霞，朱秀菊

復旦大學附屬上海市第五人民醫院檢驗科，上海 200240

維生素D是一種常見的脂溶性維生素，它主要參與鈣磷代謝，同時也是一種重要的免疫調節劑，與多種疾病(如糖尿病、高血壓、腫瘤、自身免疫性疾病等)有關[1-2]。自身免疫性甲狀腺炎(AIT)是一種自身免疫性甲狀腺疾病，屬于器官特異性自身免疫病范疇，主要表現為外周血甲狀腺特異性抗體陽性及甲狀腺淋巴細胞浸潤，其常見的臨床癥狀是甲狀腺功能減退，但其病因卻未能完全明確[3-4]。目前，維生素D與自身免疫性甲狀腺疾病的研究已成為研究熱點之一。本研究建立NOD.H-2h4小鼠實驗性AIT動物模型，給予維生素D干預，留取NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織，HE染色后觀察其組織形態學變化及淋巴細胞浸潤情況。留取NOD.H-2h4小鼠血清采用電化學發光免疫分析法(ECLI)檢測甲狀腺素(T4)、甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)、甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)水平；采用ELISA檢測NOD.H-2h4小鼠血清白細胞介素(IL)-17、IL-23水平。研究維生素D在AIT病情發生和發展中是否發揮作用，為活性維生素D3在AIT的臨床治療中提供科學理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 NOD.H-2h4小鼠在上海醫學院實驗動物中心SPF實驗室內飼養和繁殖(12 h光照/12 h避光)。所有動物的飼養及實驗均根據動物實驗指南并經過動物倫理委員會批準。選取45只雌性NOD.H-2h4小鼠(4周齡、平均體質量約20 g)隨機分為對照組、實驗組和維生素D干預組，每組各15只。

1.2儀器與試劑

1.2.1ECLI 儀器為瑞士羅氏公司生產的Cobas e601全自動免疫發光分析儀,試劑為該公司的配套試劑。

1.2.2ELISA 儀器為ELX808吸收光酶標儀(美國伯騰儀器有限公司),試劑為上海威奧生物科技有限公司生產的鼠IL-17和IL-23 ELISA試劑盒。

1.2.3維生素D 選用骨化三醇軟膠囊(蓋三淳)，由正大制藥(青島)有限公司生產，每粒0．25 μg，性狀為淡黃色至黃色的油狀液體。

1.2.4組織切片 Leica CM1950冷凍切片機(德國萊卡儀器有限公司)、Leica ST5010全自動染色機(德國萊卡儀器有限公司)和Olympus CX23顯微鏡(山東科艾瑞生物科技有限公司)。

1.3方法 對照組NOD.H-2h4小鼠同步用無菌雙蒸水喂養8周；實驗組NOD.H-2h4小鼠使用含0.005%(50 mg/L)碘化鈉的無菌雙蒸水(大約為100倍正常碘的攝入量)喂養8周，同時每2天按小鼠體質量給予無菌花生油5 μg/kg口服；維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠使用含0.005%(50 mg/L)碘化鈉的無菌雙蒸水(大約為100倍正常碘的攝入量)喂養8周，同時每2天按小鼠體質量給予5 μg/kg維生素D口服。所有NOD.H-2h4小鼠均在實驗8周后經麻醉處死。各組小鼠血液標本抽取后離心，分離血清，-80 ℃保存待測。采用ECLI檢測T4、TgAb、TPOAb水平，檢測項目均參加中華人民共和國原衛生部和上海市臨床檢驗中心室間質評，實驗同時檢測低值和高值2個質控，結果均在控；采用ELISA檢測血清IL-17、IL-23水平，試驗步驟及條件嚴格按照試劑盒說明書要求執行。NOD.H-2h4小鼠經麻醉處死后取出甲狀腺組織，處理成石蠟切片，并進行HE染色，觀察淋巴細胞浸潤情況并進行甲狀腺炎癥程度評分，試驗步驟按照相關儀器操作規程執行。

2 結 果

2.13組NOD.H-2h4小鼠AIT發生率及血清甲狀腺相關指標水平比較 與對照組比較，實驗組和維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠AIT發生率差異均有統計學意義(P<0.05)，但實驗組與維生素D干預組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，實驗組和維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；血清T4水平在各組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與實驗組比較，維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組NOD.H-2h4小鼠AIT發生率及血清甲狀腺相關指標水平比較

2.23組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織形態學觀察 3組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織經石蠟切片，HE染色后，光鏡下對照組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織顯示完整結構，甲狀腺濾泡形態正常，未見淋巴細胞大量浸潤；實驗組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織結構破壞明顯，甲狀腺濾泡形態發生明顯改變，見大量淋巴細胞明顯浸潤；維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織與對照組比較，有組織破壞，但沒有實驗組破壞嚴重，甲狀腺濾泡的形態改變及淋巴細胞浸潤程度都有所減輕,見圖1。

圖1 光鏡下各組NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織切片(HE染色，×400)

2.33組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平比較 與對照組比較，實驗組和維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與實驗組比較，維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平比較

3 討 論

AIT是一種臨床上常見的甲狀腺疾病，屬于器官特異性自身免疫病范疇，主要表現為血清甲狀腺特異性抗體陽性及甲狀腺組織淋巴細胞浸潤，其常見的臨床癥狀是甲狀腺功能減退，但其病因未完全明確。維生素D是一種常見的脂溶性維生素，多項研究表明，維生素D主要參與鈣、磷代謝，降低佝僂病、骨折、骨質疏松癥和骨軟化癥的發病風險，還具有免疫調節功能，可能在多種自身免疫性疾病(包括糖尿病、高血壓、腫瘤、自身免疫性疾病等)的發生和發展中起重要作用[5-8]。目前，維生素D與自身免疫性甲狀腺疾病的研究已成為研究熱點之一，大量研究認為維生素D參與免疫炎性細胞的分化過程，影響細胞因子水平，以及維生素D受體蛋白基因多態性加速免疫細胞凋亡，從而影響AIT病情的發生和發展[9-11]。

國外目前主要應用AIT動物模型進行研究[12]，本研究通過連續8周給4周齡的NOD.H-2h4小鼠喂養一定水平的碘化鈉進行小鼠AIT造模，通過小鼠甲狀腺組織病理切片和血清甲狀腺相關指標檢測顯示，NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織的結構破壞明顯，甲狀腺濾泡形態發生明顯改變，見大量淋巴細胞明顯浸潤；實驗組NOD.H-2h4小鼠AIT發生率高達93.3%，驗證了NOD.H-2h4小鼠是非常理想的研究AIT的易感建模動物。經過同步維生素D預防性干預，雖然維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠AIT發生率并沒有明顯降低，但是NOD.H-2h4小鼠甲狀腺組織形態破壞及淋巴細胞浸潤程度明顯降低。與對照組比較，實驗組和維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平均明顯升高，維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠血清TgAb和TPOAb水平較實驗組明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。結果表明，維生素D具有延緩NOD.H-2h4小鼠甲狀腺自身免疫反應損傷的作用。有文獻報道，1,25(OH)2D3有助于甲狀腺組織保持正常形態，維持血清TPOAb、TGAb等抗體及炎癥因子正常水平，延緩橋本甲狀腺炎的病情進展[13]。

2009年HORIE等[14]報道了Th17細胞在動物模型上誘導AIT發揮作用，其中Th17細胞分泌發揮效應的最主要的細胞因子是IL-17。同時，IL-23在Th17細胞的分化中也發揮重要調節作用，是Th17 細胞存活、增殖的重要細胞因子；IL-17參與AIT的發病過程，介導炎性反應和甲狀腺組織的免疫損傷。IL-23和IL-17形成特殊的炎性軸，從而激活JAK/STAT/NF-kB/P13K蛋白通路，促進炎癥因子的表達，使其在多種炎性反應和自身免疫性疾病中發揮重要作用。本研究結果顯示，實驗組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平與對照組比較，結果均明顯升高。有研究發現，在自身免疫性甲狀腺疾病患者中血清維生素D缺乏廣泛存在，維生素D的缺乏有可能影響疾病的發生和發展[10]；也有研究發現，維生素D可以通過維生素D受體降低Th17細胞的轉錄，負向調控Th17細胞，降低相關效應細胞因子的分泌[6]。維生素D干預組NOD.H-2h4小鼠通過維生素D干預，較實驗組NOD.H-2h4小鼠血清IL-17、IL-23水平表達明顯降低。

總之，維生素D在AIT發病中能減輕甲狀腺炎性反應程度，降低血清IL-17、IL-23水平，但具體機制有待進一步深入探討，最終可能為維生素D3在AIT的臨床治療中提供相關理論依據。