養殖實訓場布氏桿菌病血清學調查及防控對策

黎玉翠 陽進績 鄧宗虎 張業懷 李鳳梅

廣西農業職業技術學院動物科學技術系，南寧530007

養殖實訓場是學院畜牧獸醫專業及動物醫學專業學生開展實驗實訓教學的重要場所，也是完成職業技能培訓、鑒定的重要基地。近年來，學院為了提高辦學水平，加大了試驗經費投入，養殖實訓場條件獲得了很大的改善，特別是試驗動物的種類和數量與之前比增加許多。試驗動物主要有豬、牛、羊、犬、家禽及家兔等畜禽，主要用于動物解剖學、生理學、外科手術學、病理學、藥理學及動物微生物學與免疫學、動物診療等多門課程試驗或實訓教學，為學生開展專業技能操作訓練、科研創新提供支撐作用也日益明顯。

實訓場的動物往往是以最低價位中標的方式進行采購，有的中標單位為了降低購買成本會從無資質單位或農村散戶、農貿市場等地購買試驗動物。農貿市場由于人流量大、動物種類多而更具有感染、傳播的風險。有研究[1]發現，在貿易市場的食肉動物的SARS 冠狀病毒的抗體水平比農場內高，且陽性率達80%，可見無病原動物經過農貿市場后被感染的風險也隨之增加。即使是從有資質的單位中購進試驗動物，在運輸過程中也有可能被感染。隨著學院招生規模的擴大，學生班級、人數正在不斷增多，試驗動物使用次數和使用時間都在增加，過度的使用往往會造成試驗動物免疫力的下降，從而在接觸野生動物、節肢動物等跨界動物時就存在感染布魯氏桿菌病（布病）的風險。

布魯氏桿菌病是由布魯氏桿菌引起的人畜共患傳染病。布魯氏桿菌病能感染多種動物，牛、羊、豬最易感，犬、人也可感染。動物患病后引起母畜流產、空懷和不孕，公畜發生睪丸炎癥狀；人感染后，多數病例有2 周左右的潛伏期，然后才開始出現癥狀，以波浪熱為特征的發熱、出汗及渾身乏力癥狀，隨著病情的加重關節出現腫痛，特別是下肢較為明顯，后期出現跛行，對病人的生殖系統產生一定的影響，表現為男性患睪丸炎，女性可能會出現卵巢炎、子宮內膜炎等。布魯氏桿菌病是世界動物衛生組織規定必須通報的動物疫病“兩病”之一，《中華人民共和國動物防疫法》將其列為二類動物疫病，《中華人民共和國傳染病防治法》將其列為乙類傳染病，并且該病在《國家中長期動物疫病防治規劃》（2012-2020年）與結核病、血吸蟲病、狂犬病等列入優先防控的動物疫病[2]。目前，由于基層動物衛生監督力量有限，逃避檢疫、私屠濫宰現象存在，給該病的防控工作帶來新的挑戰。為了掌握養殖實訓場布魯氏桿菌病（布病）的流行情況，保障動物的健康及師生的安全。本試驗對該場所有易感動物進行布魯氏菌病的血清學檢測，現將血清學檢測情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 組建檢測隊員

每次檢測啟動前，由課題負責人根據團隊學生的特長和可利用的課余時間，靈活安排開展現場檢測和采樣時間及人員分工，并負責檢測過程中遇到特殊問題及時與指導教師的協調和處置。

1.2 準備檢測物品

手套、口罩、一次性注射器、離心管、推剪工具、75.0%酒精棉球、標簽紙、記號筆、廢棄物收集桶等物品。

1.3 明確采血操作程序

采血最好選擇早上空腹狀態下靜脈采集，采集后裝血的離心管斜面擺放，凝固后放入37 ℃的恒溫培養箱1 h，接著放入4 ℃冰箱保存。牛采用尾根靜脈采血3～5 mL 即可；羊采用頸靜脈采血；犬采用正中靜脈采血，位于前肢腕關節前方2～3 cm 處。現場采血時成員之間明確分工又齊心協作，一般是2人負責保定，1 人負責剪毛、消毒，并在動物上作記號，1 人負責采血并注入離心管，另外1 人負責血樣編號和保存血樣[3]。由于采血是利用課余進行，時間不多，每次只采集1 種動物。

1.4 分離血清

待血清晰出后進行血清分離，對有溶血或不釋出血清的動物再重新采血，將分離好的血清進行編號、分裝、放入-20 ℃冰箱冷凍備用。

受非洲豬瘟影響，采樣期間養殖場沒有豬只飼養，只采集了牛、羊、犬3 種易感動物，共采集了牛8份、羊10 份、犬31 份，共計49 份血清。

1.5 檢測樣品

參照動物布氏桿菌診斷技術國家標準進行實驗室檢測。

1）診斷液。布氏桿菌病虎紅平板凝集試驗和布氏桿菌病試管凝集試驗抗原、陽性血清、陰性血清均購自中國獸藥監察所，按說明書進行使用。

2）檢測方法。所有待檢血清先用虎紅平板凝集試驗進行檢測，篩選出的陽性血清樣品再用試管凝集試驗進行定性檢測，具體方法如下。

①虎紅平板凝集試驗（PAT）方法及判定標準：參照國家標準GB/T18646-2002 動物布氏桿菌診斷技術的操作方法進行操作。先在1 張潔凈的載玻片上滴加20 μL 抗原，隨后加入20 μL 待檢血清，攪拌混勻并攤成薄薄1 層，方便觀察結果。同時在玻片的另一端分別設立陽性和陰性血清對照。在4 min 內出現肉眼可見凝集現象且液體透明判為陽性；無凝集現象，且液體呈均勻粉紅色者判為陰性。

②試管凝集試驗（SAT）方法及判定標準：參照國家標準GB/T18646-20 動物布氏桿菌診斷技術的操作方法進行操作。首先稀釋血清，稀釋濃度依樣品的種類而定。羊血清稀釋梯度為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200；牛血清的稀釋梯度為1∶50、1∶100、1∶200、1∶400；犬血清的稀釋梯度為1∶20、1∶40、1∶80、1∶160[4]。

隨后加入等量稀釋后的抗原，混合均勻。同時做陰性對照和陽性對照及抗原對照，并正確配置比濁管。將所有的試管、陰性對照和陽性對照管及比濁管充分振蕩后放入37 ℃溫箱24 h 后，取出檢查并記錄好結果。參照比濁管，按各試管上層液體清亮度及管底凝集物的凝集程度判讀：“＋＋＋＋”表示菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；“＋＋＋”表示菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；“＋＋”表示菌體凝集顯著，液體50%清亮；“＋”表示菌體有凝集，液體25%清亮；“－”表示凝集物無沉淀，液體均勻混濁。

3）判定標準。虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗結果的判定是在陽性和陰性對照成立的前提下進行。虎紅平板凝集試驗：待檢血清出現肉眼可見凝集塊，液體基本透明者判為陽性。試管凝集試驗：牛待檢血清，稀釋度在1∶100 出現“＋＋”以上的凝集現象時，判為陽性；羊待檢血清，稀釋度在1∶50 出現“＋＋”以上的凝集現象時，判為陽性；犬待檢血清，稀釋度在1∶80 出現“＋＋”以上的凝集現象時判為陽性[5]。

2 結果與分析

由養殖實訓場布氏桿菌病初檢及復檢結果可知（表1），49 份待檢血清通過布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗進行檢測，只有1 份犬血清判為可疑，其余判為陰性。對可疑血清的犬，在1 個月后重新采血、分離血清，進行布氏桿菌病的試管凝集，結果仍為陰性，即49 份待檢血清通過布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗進行檢測全部為陰性。

3 討 論

3.1 試驗動物布氏桿菌病的檢測不能放松

本次在養殖實訓場抽檢的試驗動物均未感染布氏桿菌病，但防城港市動物疫病預防控制中[6]（2016年）抽取防港城4 個區（縣）160 份血清進行檢測，結果陽性率為7.5%（12/160），可見當時山羊布氏桿菌病的發病率較高。青海果洛州畜牧獸醫工作站達熱卓瑪[7]對藏羊布氏桿菌病的血清學調查，抽檢的樣本中感染率是0.1%，說明當地的藏羊群中還是存有布氏桿菌病。甘肅農業大學動物醫學院王耀東等[8]對臨澤縣7 個鄉鎮的奶牛和肉羊布氏桿菌病的流行情況進行調查，結果發現抽檢的樣本中牛陽性率達0.23%，羊陽性率達0.52%。這些研究數據表明，對待布氏桿菌病絕對不能掉以輕心，而必須要經常性地開展布氏桿菌病的檢測和監測，并繼續堅持做好防控，才能確保為廣大師生提供健康安全的試驗動物。

表1 養殖實訓場布氏桿菌病初檢及復檢結果

3.2 購入試驗動物必須檢測布氏桿菌病

養殖實訓場試驗動物最好自繁自養，以降低因引種而引發感染的風險。若需引種時，應從無布氏桿菌病病原的地方購買或有資質的單位購買，并做好檢疫工作，合格后才能引進。引入后的畜禽群隔離觀察1 個月，并采血做布氏桿菌血清學檢測，判為陰性者方可混群飼養。每年進行2 次常規性檢測，以確保動物及師生的健康安全。

3.3 試驗動物生物安全管理需要更加嚴格

制定并執行嚴格的管理制度，要定期對養殖場試驗動物進行消毒、驅蟲以及免疫，確保動物的健康情況；要科學飼養管理動物，不同的試驗動物或試驗目的不同的試驗動物均不得同室飼養；避免飼養人員直接接觸畜禽動物，動物飼養人員需要進行定期的身體檢查；改善養殖場環境及動物欄舍的衛生條件，做好平時常規消毒工作；師生使用試驗動物開展科研和實訓時，一定要做好防護措施。

3.4 安全教育與培訓必不可少

重視生物安全教育與培訓是保證師生、試驗動物生物安全的基礎。師生在使用養殖實訓場進行科研、實訓實驗過程，人畜共患病生物風險無時無刻都有可能被觸及，只有安全有效的生物安全培訓教育才能在思想上引起高度重視。因此，在每年都要對新生開展1 次生物安全相關的主題培訓，讓學生充分認識到人畜共患傳染病的危害性，實訓過程的安全事項，平時的個人防護措施，被動物咬傷或抓傷或被利器碰到時，如何科學合理處理傷口，只有安全措施到位才能確保師生和社會的安全。

3.5 防控機制建立非常必要

當發生人畜共患病或動物烈性傳染病時，需要徹底地對動物飼養室與相應的實驗場所實行消毒處理，殺滅昆蟲和鼠類，并即刻向學校主管部門、當地衛生防疫部門匯報，把疫情控制在最小的范圍內，將危害降到最低。為了防止布氏桿菌病的流行和擴散，發現布氏桿菌病時不進行治理而是直接淘汰病畜。平時要堅持“預防為主”的方針，具體做法：一是接種疫苗，提高家畜的免疫力以及對于該病的抵抗能力；二是源頭上徹底消滅傳染源，家畜每年進行1 次檢測，而容易被感染的家畜每年進行2 次檢測，如查發現有家畜被感染，采取撲殺并進行無害化處理；三是切斷傳播途徑，如家畜接產都要防護安全，以免遭受不必要的感染，發現流產胎兒、胎衣等都應及時清理深埋并做好消毒，防止可能的病原菌擴散。家畜的肉蛋奶等食品生熟要分開放，要經煮熟或衛生檢驗合格后才能采購食用。

綜上所述，雖然目前沒有最佳的方法消滅布氏桿菌病，但依然可以采用有效的方法進行防控，只要在平時多注意生物安全，確保養殖場衛生，平時堅持“預防為主”的方針，并留意養殖動態，發現問題及時科學處理，就可以減少在使用動物過程中或在養殖過程中布氏桿菌病對人畜的危害。