結(jié)直腸癌組織STAT3、Foxp3、IL-6表達與臨床病理特征的相關(guān)性*

顏春輝，于燕妮*，郭莉莉

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004; 2.貴陽市第一人民醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550002)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，有著不良的生存預(yù)后，晚期轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因[1]。在疾病所有階段的5年生存率約為50%[2]。近二十年來我國CRC的發(fā)病率和病死率一直在攀升，已躍居腫瘤總發(fā)病率第4位，總死亡率第5位[3]。盡管最近在外科手術(shù)治療和化學(xué)療法方面取得了進步，但在20%～25%的患者中仍有復(fù)發(fā)，治療效果仍不理想。白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是主要的促腫瘤細胞因子，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)是STAT家族蛋白的成員，STAT3是主要的致癌轉(zhuǎn)錄因子，可以通過IL-6和IL-6受體的結(jié)合而被激活。此外，IL-6/STAT3途徑可阻斷樹突狀細胞(dendritic cells,DC)的成熟，抑制T細胞活化，并通過骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)和腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumour-associated macrophages,TAM)維持免疫抑制作用[4]。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Tregs)參與維持免疫穩(wěn)態(tài)和預(yù)防自身免疫。Treg細胞包括胸腺Treg細胞和外周Treg細胞，兩者均可通過多種不同的機制抑制免疫應(yīng)答，而叉頭盒p3(forkhead box p3,Foxp3)轉(zhuǎn)錄因子是Treg細胞發(fā)育和抑制活性的主要調(diào)節(jié)劑[5]。STAT3信號通路、Foxp3和IL-6均與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及免疫抑制有十分密切的關(guān)系。本研究回顧分析了44名CRC患者STAT3、Foxp3及IL-6的表達，旨在探討CRC患者STAT3、Foxp3及IL-6免疫組化表達情況及其與臨床病理特征的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1標本 收集2015年3月—2018年12月就診并經(jīng)病理診斷確診為CRC的患者44例作為實驗組。患者相關(guān)資料完整，未并發(fā)其他惡性腫瘤和結(jié)直腸疾病，均接受手術(shù)治療并取得CRC組織，同時收集患者臨床病理資料。實驗組中男性21例，女性23例；患者年齡23-79歲，中位年齡62歲，平均年齡61歲；有神經(jīng)侵犯7例，無神經(jīng)侵犯37例；有脈管侵犯9例，無脈管侵犯35例；高分化4例，中分化24例，低分化16例；潰瘍型36例，隆起型8例；有轉(zhuǎn)移32例，無轉(zhuǎn)移12例。此外，選取其中20例癌旁組織作為對照組。

1.1.2主要試劑 Anti-STAT3抗體、Anti-Foxp3抗體、Anti-IL-6抗體由萬類生物有限公司提供，免疫組化二抗Envsion由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 方法

用已知CRC陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照，STAT3、Foxp3、IL-6抗體稀釋度分別為1 ∶500、1 ∶400及1 ∶800，按照EnvsionTM步驟處理組織標本，5 μm連續(xù)切片，于60 ℃恒溫烤箱中烘烤30 min，晾干備用，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，H2O2溶液水浴箱孵育10 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，放入盛有檸檬酸鹽修復(fù)液的容器中，高溫高壓修復(fù)3 min，修復(fù)后冷卻至室溫，滴加山羊血清封閉20 min、滴加一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜。孵育過夜的切片在水浴箱中復(fù)溫30 min，滴加二抗后水浴箱中孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidin,DAB)試劑顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標

每張切片隨機取5個200倍視野，按著色強度及陽性細胞所占的百分比進行結(jié)果判定。著色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽性細胞數(shù)占同類細胞數(shù)的百分比評分：陰性為0分，陽性細胞數(shù)1%～25%為1分，陽性細胞數(shù)26%～50%為2分，陽性細胞數(shù)51%～75%為3分，陽性細胞數(shù)76%～100%為4分；取兩項評分的乘積作為最終分數(shù)，根據(jù)最終分數(shù)分成4個等級，0～1分為“-”，2～4分為“+”，5～8分為“++”，9～12分“+++”，將“++”和“+++”定義為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析，率的比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC中STAT3、Foxp3及IL-6蛋白的表達情況

結(jié)果顯示，STAT3、Foxp3及IL-6三種蛋白的陽性細胞在CRC組織和癌旁組織的胞質(zhì)中均有表達，但以CRC組織明顯，癌旁組織表達較少(圖1)。實驗組STAT3、Foxp3及IL-6蛋白表達明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 兩組組織標本中STAT3、Foxp3及IL-6表達(Envison，×200)

表1 兩組組織標本中STAT3、Foxp3及IL-6表達[n(%)]

2.2 STAT3、Foxp3及IL-6蛋白表達與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

CRC組織中STAT3、Foxp3及IL-6蛋白表達與患者性別、年齡、神經(jīng)侵犯、脈管受累無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；STAT3蛋白表達與腫瘤分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Foxp3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-6與腫瘤分級有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表2。

表2 STAT3、Foxp3及IL-6表達與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 CRC中STAT3、Foxp3及IL-6蛋白表達的相關(guān)性

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CRC組織中STAT3、Foxp3及IL-6蛋白表達間均無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 CRC患者STAT3、Foxp3及IL-6表達的相關(guān)性

3 討論

CRC是臨床上最常見的致命惡性腫瘤之一，預(yù)測到2030年，年齡在20至34歲之間的患者的結(jié)腸癌和直腸癌的發(fā)病率可能分別會增加90.0%和124.2%[6]。近幾十年來，越來越多的發(fā)展中國家的CRC發(fā)病率急劇上升。隨著生活條件的改善，中國CRC的發(fā)病率猛增，CRC是男性中第五大最常見的癌癥，在女性中排第四位。盡管采用了放射療法和化學(xué)療法，并且手術(shù)效果顯著改善，但大約一半的CRC患者在治療五年內(nèi)將再次復(fù)發(fā)。大多數(shù)CRC腫瘤是散發(fā)性的(70%～80%)，其中約20%是遺傳起源的。CRC患者中最常見的突變基因是APC，TP53，KRAS和PIK3CA[7]。CRC被認為是一種異質(zhì)性疾病，并且已知其源于遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的積累。異質(zhì)性疾病具有腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。理想的生物標志物應(yīng)該在腫瘤組織內(nèi)和腫瘤組織之間均具有均一的表達，以便在所有患者中用作敏感的和特異性的生物標志物。因此，由各種生物標志物組成的小組可能是解決腫瘤內(nèi)和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的好方法。檢測在CRC腫瘤組織中測試分子生物標記物，以協(xié)助疾病的預(yù)后，監(jiān)測和治療。

STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子家族的一部分，也是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，并在促進腫瘤細胞增殖，腫瘤侵襲，血管發(fā)生和免疫抑制中發(fā)揮重要作用[8]。STAT3可以被多種細胞因子激活，包括CRC中經(jīng)常出現(xiàn)的IL-6和IL-11[9-10]。已證明上皮STAT3的激活可調(diào)節(jié)腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)并影響CRC的發(fā)展。STAT3可通過對細胞周期產(chǎn)生作用來促進結(jié)腸上皮中腫瘤的發(fā)生。對于結(jié)腸癌，這一發(fā)現(xiàn)得到了以下發(fā)現(xiàn)的支持：在結(jié)腸癌細胞系中，STAT3的異源過表達或細胞因子介導(dǎo)的內(nèi)源性STAT3的激活會加速細胞增殖。STAT3激活除了在介導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用外，還在許多關(guān)鍵的腫瘤細胞途徑中起著不可或缺的作用，包括增殖、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions,EMT)和促進癌細胞活性[11]。本研究中CRC組織中STAT3陽性表達率63.6%，顯著高于癌旁組織(P<0.05)。此外本研究證實CRC組織中STAT3陽性表達率與患者性別、年齡、部位、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯、腫瘤類型無關(guān)，而與CRC組織的分化程度相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與臨床報道一致[12]。Jin等發(fā)現(xiàn)STAT3蛋白陽性CRC患者的3年和5年生存率低于STAT3蛋白陰性患者[13]。且STAT3的激活可以通過轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，MDSC的擴增和抑制NK細胞功能，對于腫瘤細胞的免疫逃逸至關(guān)重要[14]。結(jié)合本實驗發(fā)現(xiàn)可能會增加證據(jù)表明STAT3參與了CRC的進展。

Foxp3是叉頭家族的成員，F(xiàn)oxp3基因位于X染色體的Xp11.23處。Treg細胞是CD+T細胞的獨特子集，它們不觸發(fā)適應(yīng)性免疫，而是抑制免疫反應(yīng)[15]。Treg細胞可以說是用途最廣的免疫抑制細胞，并且可以像跨各種組織的免疫前哨一樣發(fā)揮作用[16]。Treg細胞的功能和發(fā)育由Foxp3調(diào)節(jié)，F(xiàn)oxp3是Treg細胞最特異性生物標志物[17]。本研究結(jié)果表明Foxp3在CRC組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，陽性表達率65.9%。且隨著癌癥的進展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，F(xiàn)oxp3在癌組織的表達進一步增加，這可能與腫瘤組織中Foxp3的表達將CD4+T輔助細胞轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生TGF-β的Treg細胞，該細胞通過釋放抑制因子來抑制細胞介導(dǎo)的免疫[18]。這與腫瘤組織中Foxp3的高表達，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對于CRC的免疫抑制至關(guān)重要。

IL-6具有四螺旋結(jié)構(gòu)是一種NF-κB調(diào)節(jié)的炎性細胞因子，可在腫瘤細胞中促進增殖和抗凋亡作用，也是參與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移的人類惡性腫瘤多效細胞因子[19]。且在多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用，例如肺癌，食道癌，乳腺癌，卵巢癌和腎癌[20]。IL-6是早期CRC腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵腫瘤啟動子[21]。相關(guān)研究表明在CRC的腫瘤細胞中，IL-6在癌癥組織中的過表達與腫瘤分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和靜脈浸潤有關(guān)[22]。因此，IL-6癌細胞表達可能是癌癥進展的相關(guān)標志。據(jù)報道，患者的血清樣品中的IL-6的表達與結(jié)腸直腸腺瘤的風(fēng)險增加相關(guān)[21]。在本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6在CRC組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.05)，IL-6陽性表達率61.4%，與臨床報道大致相符[23]。且CRC組織中IL-6的表達與腫瘤的分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-6增強慢性炎癥期，給腫瘤的生長提供了一個理想的環(huán)境。且有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞產(chǎn)生的IL-6作為生長因子與癌細胞表面膜上的特定受體相互作用，可以增強癌細胞的存活和增殖[24]。此外，IL-6/STAT3途徑可阻斷DC的成熟，抑制T細胞活化，并通過MDSC和TAM維持免疫抑制作用[4]。結(jié)合本研究結(jié)果，IL-6可能參與CRC的進展，隨著疾病嚴重程度的增加而增加。

總之，CRC組織中STAT3、Foxp3和IL-6蛋白過量表達提示患者惡性程度高，轉(zhuǎn)移可能性大，這可能與STAT3、Foxp3及IL-6蛋白的表達都能夠抑制了腫瘤的免疫應(yīng)答相關(guān)，可能與CRC的發(fā)生和進展有著密切的關(guān)聯(lián)，可以作為判斷CRC預(yù)后效果的重要參考指標之一，但三種分子在信號通路上的相互作用和聯(lián)系的具體機制尚不清楚，還有待進一步的研究。