驅動蛋白Kif5b對人臍靜脈內皮細胞血管形成的作用*

羅語思，肖美蘭，陳妍，張科

(1.貴州醫科大學附屬醫院 急診科，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 藥學院 貴州省高等學校天然藥物藥理與成藥性評價重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫科大學 基礎醫學院 現代病原生物學特色重點實驗室 & 基礎醫學院寄生蟲學教研室 & 藥學院天然藥物資源優效利用重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

多數細胞內新合成的蛋白需要由胞內各馬達蛋白經細胞骨架微絲或微管定向運輸到胞內各處，以履行其功能[1]；神經細胞、上皮細胞及大部分血管內皮細胞作為具有極性的細胞，均由馬達蛋白調控胞內新合成蛋白的運輸[1]。馬達蛋白主要由驅動蛋白超家族(kinesins，Kifs)、動力蛋白超家族(dyneins)和肌球蛋白超家族(myosins)組成，其中Kifs由4個結構域組成，分別是馬達結構域、超螺旋部分的二聚化結構域、連接馬達結構域和二聚化結構域的頸部及兩條重鏈(kinesin heavy chain，KHC)和輕鏈(kinesin light chain，KLC)共同構成的尾部[1-2]。運輸蛋白時主要通過水解三磷酸腺苷獲能供馬達結構域在細胞微管上做定向運動，其運輸的蛋白包括線粒體蛋白[3]、溶酶體蛋白(lysosome-associated membrane protein 2，LAMP2)[4]、神經細胞突觸素(synaptophysin)[5]、神經細胞突觸膜前體蛋白1(syntaxin 1)[6]以及載脂蛋白E受體2(apolipoprotein E receptor 2，ApoEr2)[7]等，上述蛋白通過與Kifs尾部結構域直接結合或通過與Kifs頸部和輕鏈間接作用而結合后以細胞微管為軌道做定向運動。目前已在哺乳動物基因組中發現45個Kifs基因，依據馬達結構域的位置不同而劃分為N-Kifs，M-Kifs和C-Kifs。Kinesin1基因家族屬于N-Kifs，Kif5b是Kinesin1基因家族重要成員，其蛋白廣泛表達在各組織細胞[1,8]。研究表明Kif5b參與了腫瘤細胞的侵襲與轉移等生物學過程[9]，如在1例非小細胞肺癌患者的轉移灶中首次發現Kif5b-Ret融合基因[10]。Ret表達產物Ret蛋白為酪氨酸激酶受體，Kif5b-Ret融合基因表達的融合蛋白由Kif5b的馬達結構域和超螺旋結構域和Ret編碼的酪氨酸蛋白激酶結構域組成，該融合蛋白通過超螺旋結構域形成同源二聚體，激活細胞內酪氨酸激酶蛋白，透過數條信號通路導致細胞癌變，因此被認為是非小細胞肺癌的下一個重要酪氨酸激酶抑制劑作用靶點[8]。同時，Kif5b亦被發現通過調控溶酶體、線粒體和金屬基質蛋白酶-1等的運輸參與乳腺腫瘤發生[11-12]。腫瘤發生發展的一個重要環節是新生血管生成，在腫瘤生長、侵襲、轉移和預后中發揮重要作用[13-14]。Kif5b是否參與調控新生血管生成尚未見報道，本研究以驅動蛋白Kif5b為研究對象，通過慢病毒系統感染HUVECs下調其表達，獲取驅動蛋白Kif5b影響HUVECs血管形成的實驗依據，為進一步開展細胞驅動蛋白通過影響血管內皮細胞形成從而參與腫瘤細胞侵襲與轉移等生物學過程的科學研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞和質粒 HUVECs為Angiogenesis Starter試劑盒內容物之一，HEK293T和慢病毒載體pLL3.7及其助手質粒(pVSVG、pGag和pRev)均由本校基礎醫學院現代病原生物學特色重點實驗室保存。

1.1.2主要試劑及儀器 Angiogenesis Starter試劑盒、細胞染料Calcein AM、轉染試劑Lipofectamine 3000、Geltrex? LDEV-無低生長因子的基底膜基質(Geltrex? Matrix)及Pierce BCA Protein Assay Kit均購自美國Thermo Fisher公司(批號A14609-01、C3099、L3000-015、A14132-02和23225)，嘌呤霉素和Tubulin單抗購自美國Sigma-Aldrich公司(批號61-385-RA和T6199)，QIAquick Gel Extraction Kit和Qiagen Plasmid Maxi Kit購自德國Qiagen公司(批號28706和12163)，Lenti-XTMp24 Rapid Titer Kit購自Takara公司(批號632200)，HEK293T細胞培養所需培養基及HUVECs培養所需左旋谷氨酰胺和青鏈雙抗購自美國Gibco公司；Gene Pulser Xcell電轉儀購自美國Bio-Rad公司，Nikon Eclipse TE2000-s倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司，MME-250金屬鹵化物光源購自日本Moritex公司，Neo sCMOS照相機購自英國牛津儀器公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HUVECs培養于含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、1%青鏈雙抗和血管內皮細胞生長因子的M200培養基；HEK293T培養于含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、100 μmol/L MEM非必須氨基酸、10%胎牛血清、500 mg/L G418和1%青鏈雙抗的DMEM培養基。

1.2.2質粒構建及鑒定 實驗分為Kif5b實驗組和Kif5b對照組2組，Kif5b實驗組是基于pLL3.7質粒和靶向降解Kif5b基因mRNA的小發夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)為基礎構建的Kif5b敲減HUVECs組，Kif5b對照組是基于pLL3.7質粒和陰性對照shRNA為基礎構建的HUVECs陰性對照組。Kif5b實驗組質粒構建，首先以人Kif5b編碼區基因序列(GenBank序列號為NM_004521.2)為模板設計shRNA以及陰性對照shRNA(表1，斜體示shRNA序列)。分別以pLL3.7空質粒為模板，表1序列為引物進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)反應，純化PCR產物和pLL3.7空質粒進行酶切連接，電轉E.coliDH5α感受態細胞后37 ℃過夜培養，獲得的陽性克隆經PCR驗證后分別命名為Kif5b實驗組質粒和Kif5b對照組質粒分別用于Kif5b敲減和對照。隨后分別提取Kif5b實驗組質粒、Kif5b對照組質粒和pLL3.7載體慢病毒系統助手質粒(pVSVG、pGag和pRev)。

表1 Kif5b實驗組和Kif5b對照組質粒構建引物(5′-3′)

1.2.3質粒重組慢病毒包裝及滴度測定 分別取Kif5b實驗組質粒或Kif5b對照組質粒 6 μg、pVSVG 2 μg、pGag 6 μg和pRev 6 μg，按轉染試劑Lipofectamine 3000操作手冊操作后加入HEK293T細胞中，培養8 h吸棄上清，加含2%胎牛血清的Opti-MEM繼續培養至48 h，收集上清并過濾，-80 ℃保存備用。Kif5b實驗組重組慢病毒和Kif5b對照組重組慢病毒滴度按照Lenti-XTMp24 Rapid Titer Kit手冊操作測定。

1.2.4重組慢病毒感染HUVECs及篩選 將等量Kif5b實驗組和Kif5b對照組重組慢病毒與M200培養基等體積混合加入HUVECs中，于37 ℃和5%CO2無菌細胞培養箱中感染48 h，以2 g/L嘌呤霉素篩選被慢病毒感染的細胞，經篩選獲得的Kif5b實驗組HUVECs即代表Kif5b實驗組，Kif5b對照組HUVECs即代表Kif5b對照組。

1.2.5Kif5b表達 首先裂解Kif5b實驗組和Kif5b對照組細胞，隨后按照Pierce BCA Protein Assay Kit操作手冊定量細胞總蛋白；取等量蛋白變性后進行Western blot實驗檢測Kif5b表達，同時以Tubulin單抗檢測內參Tubulin，按照Image J軟件操作手冊比較Kif5b實驗組和Kif5b對照組的Kif5b表達情況，實驗獨立重復3次。

1.2.6HUVECs細胞成管實驗 參考文獻[15]方法將Geltrex? Matrix按0.1 mL/孔加入預冷24孔板，37 ℃靜置30 min，將培養好的Kif5b實驗組和Kif5b對照組HUVECs按1×105細胞/250 μL培養基/孔接種入Geltrex?Matrix涂層的24孔板中，培養10 h；DPBS清洗細胞，含2 g/L Calcein AM的DPBS緩沖液于黑暗條件下繼續培養30 min，485 nm波長激發光Nikon Eclipse TE2000-s倒置熒光顯微鏡觀察記錄，每組細胞選取3孔計算細胞成管率，實驗獨立重復3次。

1.2.7HUVECs細胞劃痕實驗 參考文獻[16]方法將100 mg/L多聚賴氨酸過夜包被細胞培養皿，次日2 g/L牛血清白蛋白封閉，加M200培養基浸泡培養皿，將培養好的Kif5b實驗組和Kif5b對照組HUVECs消化后接種于培養皿，6 h后以無菌p200吸管尖將單層細胞輕柔劃開，吸棄原培養基和細胞碎片，加新培養基繼續培養。使用軟件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)通過比較劃痕實驗后0 h和9 h的圖像，計算HUVECs細胞遷移速度，實驗獨立重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Kif5b表達

Western blot實驗結果顯示，在蛋白上樣量相當的情況下，Kif5b實驗組HUVECs的Kif5b表達較Kif5b對照組下降，差異有統計學意義(P<0.05)，說明Kif5b實驗組重組慢病毒構建成功，能夠為后續實驗結果可靠性提供保證。見圖1。

注：A為Western blot實驗結果，B為Kif5b的定量表達結果；(1)與Kif5b對照組比較，P<0.05。

2.2 細胞成管率

細胞成管實驗結果顯示，Kif5b實驗組HUVECs幾乎不能形成毛細管狀結構，但Kif5b對照組細胞能夠形成該結構；Kif5b實驗組HUVECs細胞成管率明顯低于對照組，差異有高度統計學意義(P<0.000 1)，說明敲降Kif5b的HUVECs細胞成管能力明顯下降。見圖2。

注：A為細胞成管實驗熒光圖(100×)，B為細胞成管率的定量表達；(1)與Kif5b對照組比較，P<0.000 1。

2.3 細胞遷移速度

細胞劃痕實驗結果顯示，與0 h比較，9 h時Kif5b實驗組和對照組細胞HUVECs均能向劃痕中心遷移，且Kif5b實驗組HUVECs細胞遷移速度明顯低于Kif5b對照組，差異有高度統計學意義(P<0.000 1)。見圖3。

注：A為細胞劃痕實驗白光圖(100×)，紅色直線示劃痕中心位置，兩側紅色虛線示劃痕邊緣位置；B為細胞遷移速度的定量結果；(1)與Kif5b對照組比較，P<0.000 1。

3 討論

本研究以了解驅動蛋白Kif5b對HUVECs血管形成的作用為目的，探討Kif5b可能通過影響HUVECs血管形成從而參與瘤細胞侵襲與轉移等生物學過程，以pLL3.7慢病毒系統將Kif5b為目的蛋白的shRNA導入HUVECs中，下調Kif5b表達，隨后通過細胞成管實驗和細胞劃痕實驗觀察發現Kif5b對HUVECs細胞形成管狀結構和促進細胞遷移具有重要作用。

內皮細胞高表達的CD151和內皮細胞特異性分子-1(Endocan)等蛋白已被報道與血管生成密切相關，Endocan還被特別指出與腫瘤血管生成密切相關[17-18]。腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲及轉移等生物學行為的基石，近年來已有一系列關于Kif5b參與肺腫瘤和乳腺腫瘤的報道[8-12]，但有研究發現Kif5b可通過對線粒體的運輸參與Myc癌基因在轉錄階段對線粒體轉運的一系列基因網絡調控[19]，這提示Kif5b可能通過Myc對于腫瘤轉移發揮重要作用，應考慮Kif5b在腫瘤中的作用，可能不只局限于肺腫瘤和乳腺腫瘤，在多數實體腫瘤的發生和進展中也可能具有重要作用。本研究中，通過下調Kif5b表達分析出該驅動蛋白對HUVECs細胞管狀結構形成和細胞遷移能力的影響，發現下調Kif5b的表達能夠明顯抑制細胞形成管狀結構和促進細胞遷移的能力，這些證據提示驅動蛋白Kif5b很可能參與了以HUVECs為代表的人血管內皮細胞形成新生血管，進而對Kif5b在實體腫瘤侵襲和轉移過程中的作用提供了實驗依據。同時在胃部腫瘤相關研究中發現Hippo信號通路關鍵效應因子含有WW 結構域轉錄調節因子1(WW domain-containing transcription regulator protein 1，WWTR1)與Wnt 通路效應分子β-catenin高度正相關，且WWTR1與β-catenin的表達水平與HUVECs增殖和管道形成能力呈正相關[20]；已有報道顯示與WWTR1介導胞核轉運的14-3-3γ蛋白與Kif5b-KLC1高度關聯[21]。此外，還有研究使用了和本課題類似的技術下調Kif5b表達，分析了該驅動蛋白對MDCK細胞的影響，結果發現Kif5b沉默后誘導MDCK細胞經歷了上皮細胞-間充質轉化過程，去分化為間充質干細胞樣細胞[22]。上述報道為進一步拓展本研究的結論提供了方向。

綜上，本研究下調了HUVECs細胞中Kif5b的表達后，通過細胞成管實驗和細胞劃痕實驗發現Kif5b對人血管內皮細胞形成管狀結構和細胞遷移均具有正向調節作用。下一步還需通過構建Kif5b過表達系統，開展類似實驗，以及一系列如WWTR1、14-3-3γ與Kif5b互作的機制研究，同時也展開動物實驗，為進一步揭示肌動蛋白Kif5b參與血管形成的作用機制，以及其在腫瘤生長、侵襲、轉移和預后中參與新生血管形成的機制奠定更加堅實基礎。