溶瘤呼腸孤病毒聯合CD30/CD16A雙特異性抗體對NK細胞介導的ADCC效應的影響*

廖春香，龍世棋，安媛媛1，，車啟元1，，王念雪1，，陳亮，楊薇，趙星*

(1.貴州醫科大學 組織工程與干細胞實驗中心，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫學教研室，貴州 貴陽 550004；3.安順市人民醫院 胸甲乳外科，貴州 安順 561000；4.貴州醫科大學 臨床醫學院 腫瘤學教研室，貴州 貴陽 550004)

雙特異性抗體是由人工構建的在同一抗體分子上可同時特異性結合兩個不同抗原分子的一類抗體，抗體一端可通過與自然殺傷(natural killer，NK)細胞的FcγRIII結合，另一端可與靶細胞結合后促進NK細胞對靶細胞的殺傷作用[1-4]。CD30/CD16A作為一種4價的BsAbs，含有2個CD16A結合位點及2個CD30結合位點，使其在特異性連接CD30分子陽性的腫瘤細胞的同時又能特異性連接CD16A陽性的NK細胞，從而通過抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)殺傷CD30分子陽性的腫瘤細胞[5]。正常情況下，CD30分子低表達于激活的B淋巴細胞和T淋巴細胞，長期被認為是經典霍奇金淋巴瘤(hodgkins lymphoma，HL)的表面分子標志[6]，但近期研究發現非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)如間變性大細胞瘤中也有表達，且已成為CD30分子陽性的淋巴瘤患者抗體治療的理想靶點[6]。由于BsAbs的功能發揮主要依賴于NK細胞的抗腫瘤活性，因而目前很多研究都是圍繞如何增強NK細胞功能來促進BsAbs的療效[7]。本課題組前期研究工作中已發現，溶瘤呼腸孤病毒(reovirus)不僅可以促進NK細胞的抗腫瘤活性[8]，在聯合西妥昔單抗后進一步增強NK細胞介導的ADCC作用，進而抑制裸鼠腫瘤的生長[9]。因此，本研究通過體外實驗檢測reovirus聯合(CD30/CD16A)BsAbs對于NK細胞抗腫瘤活性的影響，從而為探索NHL等淋巴瘤的治療新策略奠定理論及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株和病毒 高表達CD30分子的人間變性大細胞瘤KARPAS-299細胞株、高表達CD20分子的人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株、人結直腸癌DLD-1細胞株及reovirus 3型(Type 3 dearing，T3D)均由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑和儀器 人NK細胞分離試劑盒(德國Miltenyi Biotec)，人外周淋巴細胞Ficoll分離液(英國GE)，DNaseⅠ(中國 Solarbio)，流式抗體抗人FITC-anti CD3、抗人PE-anti CD56、抗人APC-anti CD69及抗人APC-anti CD107a抗體(美國Biolegend)，抗人FITC-anti CD30抗體(美國BD)，熒光二抗FITC-IgG(美國Jackson Immuno Research)，CD30/CD16A BsAbs(美國斯坦福大學Holbrook Kohrt教授惠贈)，PRMI1640培養基、低限量Eagle培養基(minimum Eagle’s medium，MEM)培養基、青霉素及鏈霉素、胰酶(美國Sigma-Aldrich)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS；美國Gibco)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒(美國Biovision)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；美國Sigma-Aldrich)；多功能酶標儀SYNERGY H1(美國Bio Tek)，FC500分析型流式細胞儀(美國Beckman)，CO2細胞恒溫培養箱(美國Thermo Fisher)，倒置顯微鏡(日本Nikon)，5810低溫離心機(德國Eppendorf)，-80 ℃超低溫冰箱(美國Thermo Fisher)，生物安全柜(山東Biobase生物)。

1.2 方法

1.2.1人NK細胞的分離、純化及鑒定 采集健康獻血者肝素抗凝靜脈血30 mL，按1 ∶1的體積比加入生理鹽水稀釋血液，混勻備用；50 mL離心管內加入淋巴細胞分離液25 mL，各管分別加入稀釋后的血液20 mL，2 500 r/min離心10 min，取中間白膜層即為分離出的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，生理鹽水清洗2次，去除上清，加磁珠分選緩沖液(magnetic-activated cell sorting buffer，MACS buffer)500 μL重懸，按每1×107個NK細胞加Biotin-antibody 10 μL的比例將二者混勻，4 ℃孵育5 min，加MACS buffer 30 μL及NK細胞MicroBead 20 μL，4 ℃孵育10 min，MACS buffer將體積調整為500 μL后用200目過濾器除去細胞團塊，將過濾后的細胞經免疫磁珠篩選，分離獲得的NK細胞立即使用或于液氮中保存，1個月內使用。

1.2.2LDH釋放法檢測reovirus活化的NK細胞抗腫瘤活性 從液氮罐中復蘇NK細胞，分別與10及100 感染復數(multiplicity of infection，MOI)的reovirus于37 ℃的5%CO2溫箱中孵育過夜(Reo-NK組)；次日取出細胞調整濃度至3×103個/L，以Reo-NK或未經reovirus處理的NK為效應細胞、DLD-1為靶細胞，按效靶比為5 ∶1的比例加Reo-NK/NK及DLD-1細胞，同時設實驗孔(效靶細胞各100 μL)、靶細胞自然釋放孔(靶細胞及培養基各100 μL)、靶細胞最大釋放孔(靶細胞100 μL及Triton液各100 μL)及效應細胞自然釋放孔(靶細胞及培養基各100 μL)；細胞培養板置于溫箱中孵育3.5 h，孵育結束前30 min在靶細胞最大釋放孔中加入裂解液10 μL充分混勻；多孔板離心機1 200 r/min離心5 min，取上清液，加到標記好的新96孔板中，每孔加LDH工作液50 μL，混勻置于室溫避光孵育30 min；用酶標儀于490 nm處檢測光密度值(optical density，OD)，并計算DLD-1細胞的死亡率(killing rate)[死亡率(%)=(實驗孔OD值-靶細胞自然釋放孔OD值-效應細胞自然釋放孔OD值)/(靶細胞最大釋放孔OD值-靶細胞自然釋放孔OD值)×100%]。

1.2.3流式細胞術檢測KARPAS-299細胞膜表面CD30分子的表達 取1×106個KARPAS-299細胞，900 r/min離心5 min，去除上清；加入流式緩沖液1 mL重懸洗滌，1 200 r/min離心5 min，棄上清；加入Fc封閉液5 μL室溫孵育20 min，分別對應加入抗人APC-CD30及同型對照抗體IgG1各5 μL，避光孵育30 min，加1×PBS重懸后1 500 r/min離心8 min，去除上清液；加1×PBS約500 μL重懸細胞，經200目細胞篩過濾后用貝克曼FC500流式細胞儀檢測KARPAS-299細胞膜表面CD30分子的陽性率，結果用Flowjo 10軟件進行分析。

1.2.4Reo-NK聯合CD30/CD16A對KARPAS-299細胞的殺傷效應 將NK細胞作為效應細胞用1 MOI的reovirus預處理(Reo-NK)，置細胞培養箱內培養12 h；KARPAS-299細胞作為靶細胞，將同型對照抗體IgG1或CD30/CD16A按不同濃度[(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00及1 000.00)×10-12mol/L]與靶細胞共孵育2 h，靶細胞按6×104個/孔接于U型96孔反應板，NK/Reo-NK與KARPAS-299細胞及Raji細胞的效靶比均為1 ∶1，組別設置為NK+IgG1組、NK+CD30/CD16A組、Reo-NK+IgG1組及Reo-NK+CD30/CD16A組，同時設空白對照孔(RPMI1640 100 μL)、靶細胞自然釋放孔(靶細胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、靶細胞最大釋放孔(靶細胞50 μL+RPMI1640 50 μL+裂解液10 μL)、效應細胞孔(效應細胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、效應細胞自然釋放孔(效應細胞50 μL+RPMI1640 50 μL)等對照組，置溫箱中孵育4 h；孵育結束前30 min在靶細胞最大釋放孔中加裂解液10 μL充分混勻；1 200 r/min離心5 min，收集上清液至新的96孔板中，加LDH工作液50 μL，充分混勻，置于室溫避光孵育30 min；酶標儀于490 nm處檢測OD，并計算死亡率。

1.2.5流式細胞術檢測NK細胞表面分子的表達 流式細胞術檢測不同滴度reovirus(0.0、0.1、0.5、1.0、10.0、100.0 PFU)及人結直腸癌DLD-1細胞對NK細胞活化標志物CD69分子、細胞毒性標志物CD107a分子表達的影響。具體操作：取1×107個NK細胞，設置為Reo-NK組和Reo-NK+DLD-1組，同時加不同滴度的reovirus過夜；次日Reo-NK+DLD-1組加入按5 ∶1的效靶比加入靶細胞DLD-1，孵育5 h；Reo-NK組及Reo-NK+DLD-1組均以900 r/min離心5 min，去除上清；加流式緩沖液1 mL重懸洗滌，1 200 r/min離心5 min，棄上清；加Fc封閉液5 μL室溫孵育20 min，分別對應加抗人APC-CD69、抗人APC-CD107a、抗人PE-CD56及抗人FITC-CD3流式抗體各5 μL，避光孵育30 min，加1×PBS重懸后1 500 r/min離心8 min，去除上清液；加緩沖液500 μL重懸細胞，經200目細胞篩過濾后用貝克曼FC500流式細胞儀進行檢測CD69及CD107a的陽性率，并用Flowjo 10軟件進行結果分析。

1.2.6Reo-NK聯合CD30/CD16A對Raji細胞的殺傷效應 將NK細胞作為效應細胞用1 MOI的reovirus預處理(Reo-NK)，置細胞培養箱內培養12 h；Raji細胞作為靶細胞與不同濃度[(0.00、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00及1 000.00)×10-12mol/L]的CD30/CD16A 共同孵育2 h后，按6×104個/孔接于U型96孔反應板，按照1 ∶1的效靶比加入NK及Reo-NK細胞。實驗設置為NK+CD30/CD16A組和Reo-NK+CD30/CD16A組，同時設空白對照組(RPMI1640 100 μL)、靶細胞自然釋放組(靶細胞50 μL+RPMI1640 50 μL)、靶細胞最大釋放組(靶細胞50 μL+RPMI1640 50 μL+裂解液10 μL)、效應細胞組(效應細胞50 μL+RPMI1640 50 μL)及效應細胞自然釋放組(效應細胞50 μL+RPMI1640 50 μL)，置溫箱孵育4 h；孵育結束前30 min在靶細胞最大釋放孔中加裂解液10 μL充分混勻；1 200 r/min離心5 min，收集上清液至新的96孔板中，加LDH工作液50 μL，充分混勻，置于室溫避光孵育30 min；用酶標儀于490 nm處檢測OD，并計算死亡率。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 NK細胞表型

流式檢測結果顯示，體外新鮮分離的NK細胞純度及CD3-CD56+的細胞群可達70%以上。見圖1。

圖1 新鮮分離的NK細胞純度

2.2 Reovirus促進NK細胞的抗腫瘤活性

LDH檢測結果顯示，與單獨NK組相比，Reo-NK對DLD-1細胞的殺傷率明顯增強，差異有高度統計學意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與NK組比較，P<0.01。

2.3 Reovirus、DLD-1細胞對NK細胞活化標注物CD69和細胞毒性分子CD107a表達的影響

流式檢測結果顯示，隨著reovirus滴度的上升，NK細胞活化標志物CD69與其細胞毒性分子CD107a的表達呈上升趨勢，且在同reovirus滴度下(100 PFU)經DLD-1處理的NK細胞表面的CD69及CD107a分子的陽性率相對未經DLD-1處理的NK細胞增加更為明顯(P<0.05)。見圖3。

注：與0.0 PFU組相比，(1)P<0.05，(2)P<0.01；A為流式細胞儀檢測十字門結果，B為流式檢測的統計結果。

2.4 KARPAS-299表面VD30分子的檢測及reovirus聯合(CD30/CD16A)BsAb對NK細胞介導的ADCC效應的影響

LDH釋放實驗檢測結果顯示，NK+CD30/CD16A組與NK+IgG1組相比，對KARPAS-299細胞殺傷能力增強，差異有統計學意義(P<0.05)；Reo-NK+IgG1組與NK+IgG1組相比，對KARPAS-299細胞殺傷能力增強，差異有統計學意義(P<0.05)；Reo-NK+CD30/CD16A組與Reo-NK+IgG1組相比，對KARPAS-299細胞殺傷能力增強，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為KARPAS-299細胞表面CD30分子檢測，B為reovirus聯合不同濃度的(CD30/CD16A)BsAb對KARPAS-299細胞的殺傷作用檢測結果；(1)與同濃度NK+IgG1組相比，P<0.05;(2)與同濃度Reo-NK+IgG1組相比，P<0.05。

2.5 NK細胞聯合(CD30/CD16A)BsAb對Raji細胞的細胞毒作用

在未經reovirus處理的NK+CD30/CD16A組的抗腫瘤效應中，各濃度(CD30/CD16A)BsAb均未顯著促進NK細胞對Raji細胞的殺傷效應，而經reovirus活化的NK+CD30/CD16A組對Raji細胞的殺傷效應顯著(P<0.05)。見圖5。

注：(1)與NK+CD30/CD16A組比較，P<0.05。

3 討論

NK細胞是機體具有細胞毒性的免疫細胞之一，在體外可以通過白細胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、IL-15、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)等多種細胞因子活化[10-17]。NK細胞在腫瘤的免疫治療中發揮抗腫瘤效應的重要機制之一是ADCC作用[16, 18-20]。而CD16分子是NK細胞啟動ADCC效應過程中是不可或缺的條件，在許多基于抗CD16抗體的腫瘤治療中，由于只能特異性連接1個抗原靶點，其特異性相對較低且分子量小，易產生脫靶效應[21-24]。與之相比，由于雙特異性抗體具有可同時特異性連接2種抗原靶點、連接穩定不易脫靶等優勢，目前已成為治療性抗體研究的熱點[25-26]。據報道，目前已有80余種雙特異性抗體正處于臨床研究各階段，其中包括世界首例批準上市的用于治療惡性腹水的卡妥索單抗、后續上市的用于治療腫瘤性腹水的EpCAM/CD3及用于治療B型淋巴細胞白血病的CD19/CD3[4,24]等，在臨床實驗中，這些抗體均呈現出較好的靶向性和特異性。

本研究探討了reovirus在NK細胞活化中的作用以及聯合雙特異性抗體(CD30/CD16A)BsAb對CD30分子陽性腫瘤細胞的作用。通過流式檢測及殺傷實驗發現reovirus可以活化NK細胞，促進NK細胞表面活化標志物CD69、CD107a分子的表達；流式細胞儀檢測結果可見，KARPAS-299細胞CD30分子的陽性率為90%以上，呈高表達狀態。同時，為了進一步驗證(CD30/CD16A)BsAb對CD30高表達的腫瘤細胞KARPAS-299細胞的特異性，本研究將CD20+CD30-的Raji細胞作為對照，用reovirus預處理的NK細胞聯合(CD30/CD16A)BsAbs后殺傷Raji細胞，通過LDH釋放試驗檢測殺傷效應。實驗結果顯示增強NK細胞對人結直腸癌DLD-1細胞株、人間變性大細胞瘤KARPAS-299細胞株及人Burkitt淋巴瘤Raji細胞株等多種腫瘤細胞的殺傷效應。在LDH釋放試驗檢測KARPAS-299細胞死亡率實驗中觀察到：reovirus可以增強NK細胞對腫瘤細胞的殺傷效應，而(CD30/CD16A)BsAbs可以進一步促進NK細胞對KARPAS-299細胞的殺傷效應且與(CD30/CD16A)BsAbs呈濃度依賴性，但在同型對照IgG1組則未觀察到NK細胞殺傷能力與抗體有關，如當CD30/CD16A及IgG1濃度同為1.00×10-12mol/L時，Reo-NK+CD30/CD16A組對KARPAS-299細胞的細胞毒作用較Reo-NK+IgG組顯著；當CD30/CD16A及IgG1濃度均上升為10.00×10-12mol/L時，Reo-NK+CD30/CD16A組對KARPAS-299細胞的細胞毒作用較Reo-NK+IgG組顯著，同樣，當CD30/CD16A及IgG1濃度進一步上升至100.00×10-12mol/L時，Reo-NK+CD30/CD16A組對KARPAS-299細胞的細胞毒作用較Reo-NK+IgG組提高更為顯著。此外，本研究結果顯示，reovirus活化的NK細胞降低了NK細胞介導的ADCC效應所需的抗體量，如在細胞死亡率同為5%時，經reovirus活化的NK細胞僅需聯合1.00×10-12mol/L的CD30/CD16A，而未經reovirus活化的NK細胞需聯合100.00×10-12mol/L的CD30/CD16A才能達到相同殺傷效應。在(CD30/CD16A)BsAbs存在條件下，無論是NK細胞還是經reovirus活化的Reo-NK細胞，其殺傷效應均能隨著(CD30/CD16A)BsAbs濃度的升高有不同程度的增強，特別是Reo-NK的抗腫瘤效應增加更顯著，該結果表明reovirus不僅能促進NK細胞的抗腫瘤效應，還能聯合(CD30/CD16A)BsAb通過NK細胞介導的ADCC效應進一步殺傷CD30陽性的KARPAS-299細胞且殺傷能力呈抗體濃度依賴性。在CD20+CD30-的Raji細胞殺傷試驗中可以觀察到：隨著(CD30/CD16A)BsAbs濃度增加，NK細胞對Raji細胞的殺傷效應無顯著增強，在reovirus活化的NK細胞中雖然殺傷效應顯著上升，但未呈現出濃度依賴性，表明(CD30/CD16A)BsAbs在靶向分子CD30缺失情況下，不能促進NK細胞的抗腫瘤效應，該結果證明了(CD30/CD16A)BsAbs對CD30+的腫瘤細胞的殺傷具有特異性。

綜上所述，reovirus不僅可以促進體外新鮮分離的NK細胞活化，增強其抗腫瘤效應，而且在聯合雙特異性抗體(CD30/CD16A)BsAbs后還能進一步促進NK細胞特異性識別高表達CD30分子的靶細胞，進一步增加NK細胞介導的ADCC作用。本研究結果僅顯示體外實驗研究的部分結果，雙特異性抗體聯合NK細胞抗腫瘤的具體機制研究尚未完成，在抗腫瘤中的安全性及有效性有待進行動物實驗作進一步的研究，且體內的抗腫瘤效應比體外實驗所能研究的復雜得多，還有很多體內實驗有待完成。通過本次研究可為后續深入探索reovirus聯合(CD30/CD16A)BsAbs抗腫瘤機制研究以及臨床應用提供理論及實驗基礎。