高壓氧促進小鼠脊髓損傷后功能恢復

廖小俊 李 蘭 陳亞星 文澤賢

脊髓損傷包括原發性和繼發性損傷，原發性損傷不可逆，治療重點在繼發性損傷[1]。高壓氧治療（hyperbaric oxygen，HBO）可減少脊髓損傷后繼發性損傷[2]，機制主要有減輕炎癥反應、抑制神經元凋亡、減輕脊髓水腫、促進血管再生、促進軸突再生等[3]。Nrf2具有神經保護作用，是否參與HBO 治療脊髓損傷的機制，目前尚不清楚。本研究擬采用小鼠脊髓損傷模型，分析HBO治療對小鼠脊髓損傷后Nrf2的影響，進一步探討HBO治療脊髓損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組45 只成年雌性ICR 小鼠[購于北京華阜康生物科技股份有限公司，體質量（24±2）g]按隨機數字表法分為3 組假手術組（A 組，n=15）、模型組（B組，n=15）、HBO組（C組，n=15）。

1.2 動物模型建立 腹腔注射4%水合氯醛（10 ml/kg）麻醉小鼠，以T11 棘突為中心，在背部正中做長約2 cm切口，依次切開皮膚、皮下組織，切開椎旁肌向兩側分離，顯露T9～L1 椎體棘突及椎板。小鼠左側第13肋骨脊柱發出部位為T12與L1交界處，以此判定T11脊椎位置。咬除T11椎體棘突及背側椎板，血管夾從左右兩側將T11節段脊髓壓迫至0.2 mm[4]，持續15 s，保持脊膜完整，止血、縫合各層組織。假手術組只打開椎板，不損傷脊膜及脊髓。術后置于暖光燈下復蘇，蘇醒后BMS 評分0 分判斷為建模成功。術后分籠飼養，每天擠壓膀胱協助排尿2次。

1.3 HBO 治療方法及管理 將HBO 組小鼠置于動物實驗高壓氧倉，加壓10 min 使倉內壓力達到0.2 Mpa，倉內氧濃度達到95%以上，穩壓吸氧40 min[5]，每日1次，共7 d。造模后護理：每日按壓膀胱排尿2次，間隔12 h，直至小鼠排便功能基本恢復。

1.4 小鼠后肢運動功能評分 造模后1、7、28 d 采用BMS 評分法[6]評估小鼠后肢運動功能恢復情況，每組5只。將小鼠置于直徑100 cm、高30 cm的塑料盆持續觀察，按評分標準相應判分，0分表示后肢完全癱瘓，9分表示運動功能正常。

1.5 免疫熒光染色 造模后7 d取損傷部位脊髓組織及假手術組相應部位脊髓組織行免疫熒光染色，每組5只。以4%多聚甲醛溶液灌注固定后，分離脊髓組織，4%多聚甲醛溶液4 ℃后固定24 h，30%蔗糖溶液脫水過夜，取出脊髓組織，以損傷部位為中心，前后各留取5 mm，剪去多余脊髓，冰凍切片，厚度14 μm。將切片于50 ℃烤箱中烘烤1 h，PBS 漂洗，4%多聚甲醛浸泡，1% Triton X-100 通透細胞膜，10%正常山羊血清封閉，滴加兔抗Nrf2 多克隆抗體（1∶200，美國Abcam 公司）4℃孵育過夜，滴加Cy3 標記山羊抗兔IgG 抗體（1∶200，美國Beyotime 公司）37 ℃孵育2 h，DAPI 染色，抗熒光淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.6 免疫印跡法檢測細胞核Nrf2蛋白表達 造模7 d，取損傷部位脊髓組織及假手術組相應部位脊髓組織，每組5只。小鼠麻醉后快速取出脊髓組織，以損傷部位為中心，前后各留取5 mm，剪去多余脊髓。將脊髓標本以細胞核蛋白抽提試劑盒抽提蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測濃度，濃度調定一致后等體積上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，濕轉到PVDF膜，封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜（Nrf2，1∶500）；二抗孵育2 h，化學發光液顯影，用Image Lab 軟件分析各條帶相對值。

1.7 統計學方法 應用SPSS 20.0軟件分析；計量資料以±s表示，行單因素方差分析；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組小鼠后肢功能評分比較 假手術組各時間點BMS 評分均為9 分，后肢運動功能無明顯異常。造模后1 d，模型組和HBO 組BMS 評分均為0 分，后肢完全癱瘓。造模7 d，模型組BMS 評分仍為0 分；HBO 組MBS評分明顯高于模型組（P＜0.05，表1），明顯低于假手術組（P＜0.05，表1）；提示后肢功能有所恢復。造模后28 d，模型組和HBO組BMS評分均明顯提高（P＜0.05，表1），HBO 組提高更明顯（P＜0.05，表1）。

表1 各組小鼠BMS評分比較（分）

2.2 免疫熒光染色結果 免疫熒光染色顯示細胞核為藍色，Nrf2為紅色。激光共聚焦顯微鏡觀察，各組細胞核染色無差別，假手術組Nrf2染色較弱，模型組Nrf2 染色明顯增強，可見脊髓損傷后Nrf2 表達增加。藍色細胞核與紅色熒光重疊表示Nrf2發生核移位，假手術組未見明顯Nrf2核移位，HBO組與模型組均可見部分細胞核藍色熒光與紅色熒光重疊，存在Nrf2 核移位；而且，HBO 組紅色熒光更強，發生Nrf2核移位更多，可見HBO明顯促進Nrf2的表達及核移位。見圖1。

2.3 細胞核Nrf2 蛋白表達變化 HBO 組及模型組Nrf2 表達量均較假手術組明顯增加（P＜0.05，圖2），而且HBO組細胞核Nrf2表達量明顯高于模型組（P＜0.05，圖2）。這說明脊髓損傷后Nrf2 被激活發生核移位發揮生物學功能，HBO 干預可進一步促進Nrf2核移位。

3 討論

圖1 小鼠脊髓損傷后損傷脊髓組織Nrf2免疫熒光染色情況

圖2 高壓氧治療對脊髓損傷小鼠損傷脊髓組織Nrf2表達的影響

脊髓損傷后原發性損傷已不可逆轉，積極干預繼發性損傷是提高療效的關鍵。繼發性損傷的機制主要有炎癥反應、氧化應激、鈣超載、自由基形成等[7]。HBO 治療減輕神經繼發性損傷包含多種機制：抑制白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9、核轉錄因子-κB等炎癥因子表達[8]，減輕炎癥反應；抑制Caspase-3 表達，減少脊髓神經元凋亡[9]；促進血管內皮生長因子表達，發揮神經保護作用[10]；促進脊髓損傷后軸突再生、損傷區域血管重建、減輕脊髓水腫[11]。

Nrf2是一種細胞保護性轉錄因子，生理狀態下，與細胞骨架相關蛋白keap1結合，存在于細胞漿中，無活性、易降解。當細胞受到自由基、化學性物質刺激時，keap1 被磷酸化或者Nrf2 直接被磷酸化，Nrf2與keap1解離進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidative response element，ARE）啟動子區域結合，調控ARE 下游抗氧化酶及解毒酶表達，發揮抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗凋亡、清除自由基等作用[12]。另外，Nrf2具有抑制炎癥反應、減輕膜性結構氧化性損傷、保護血腦屏障、減輕腦水腫等神經保護作用[13]。

本研究結果表明，小鼠脊髓損傷后HBO治療明顯促進后肢運動功能恢復。這與既往文獻報道一致[14]。本文免疫熒光染色可見HBO組Nrf2核移位明顯增加，免疫印跡法檢測發現HBO組細胞核Nrf2蛋白含量明顯增高。這與既往文獻報道相符[15]。

總之，HBO 治療顯著促進小鼠脊髓損傷后神經功能恢復，機制可能與促進Nrf2表達及核移位有關。