維吾爾族煙霧病病人血清miRNA的異常表達及其基因分析

李海蒙 周廣平 水 政 俞 輝 孫育海 洪 波

煙霧病是一種原因不明、以顱內大動脈閉塞伴顱底異常血管網生成為特點的疾病[1]。煙霧病的發生是多種因素共同作用的結果，具有易感基因的人群，在感染、炎癥在內的多種因素作用下，導致顱內大動脈內膜增厚伴纖維增生，最終導致相關血管狹窄甚至閉塞，并促使代償血管異常擴張、增生，其中相關血清miRNA 的表達在其發生過程中起重要的作用。由于煙霧病的發病率具有明顯的地區和種族差異，提示不同種族的致病基因和發病機制存在多樣性[2]。目前，關于煙霧病的研究對象多集中在東亞人種[3]，而維吾爾族（簡稱維族）人群煙霧病的基因研究仍處于空白階段。本文以維族煙霧病病人為研究對象，通過miRNA芯片技術篩選煙血清異常表達的miRNA，隨后通過生物信息學方法分析跟煙霧病相關的基因，為維族煙霧病的診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2017 年2 月至2018 年8 月新疆莎車縣人民醫院救治的8 例維族煙霧病與8 例維族健康者（對照組）的血樣。煙霧病均由腦血管造影證實且為雙側頸內動脈病變，排除文獻已證明可以伴有煙霧病綜合征的疾?。ㄖ袠猩窠浵到y感染、結締組織病等）。兩組性別、年齡及白細胞計數、血沉、血膽固醇水平等均無統計學差異（P＞0.05，表1），但煙霧病組血糖水平明顯高于對照組（P＜0.05，表1）。8 例煙霧病臨床表現見表2。本研究獲得新疆喀什地區莎車縣人民醫院倫理委員會通過。

1.2 檢測方法

1.2.1 采血 采集外周靜脈全血約5 ml，30 min內以4 000轉/min離心15 min，緩慢吸取上層血漿立即放置于-80 ℃冰箱保存后待測。

1.2.2 建立血清池 完成所有血漿收集后，每個標本取150 μl血漿充分混勻，形成1.2 ml血清池。

1.2.3 提取血清總RNA 從血清池中取500 μl 樣本，加入500 μl TRIzol（美國Invitrogen 公司）充分旋渦震蕩后室溫靜置5 min，使其充分裂解；再加入200 μl異丙醇，充分混勻，4 ℃、12 000 轉/min 離心15 min后，吸取上清液1 ml；加入500 μl氯仿，搖勻，旋渦震蕩30 s，室溫靜置3 min，然后4 ℃、12 000轉/min離心15 min，吸取上層清液，加0.75 體積的異丙醇，搖勻后室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 轉/min 離心10 min；收集含RNA 的沉淀，用75%乙醇重懸沉淀，4 ℃、8 000轉/min離心5 min，收集含RNA的沉淀，用300 μl DEPC水（美國Sigma公司）重懸沉淀待測。

1.2.4 測定RNA濃度 取1 μl含RNA的提取液，加入99 μl 的DEPC 水稀釋。采用SMA3000 光度計檢測，選擇“RNA”，將RNA 稀釋倍數設定為100。使用雙蒸水反復清洗比色杯3次，加入100 μl的DEPC水調零。加入稀釋好的RNA 提取液，開始檢測，分別測量A280 nm 和A260 nm 的光密度（optic density，OD）值，A260/A280值在1.8～2.0，以保提取RNA的純度。

表1 兩組基線資料比較

表2 8例煙霧病臨床表現

1.2.5 miRNA 測序及篩選 采用Exiqon miRCURY LNA microRNA 芯片（丹麥Exiqon 公司）高通量技術檢測miRNA 表達譜。應用小芯片構建單分子陣列，橋式PCR擴增檢測信號。PCR每個循環中將四種熒光標記的dNTP 和DNA 聚合酶添加到單分子陣列中，激光激發與dNTP 結合的標記熒光信號，并使用計算機化分析系統將光信號轉換為測序堿基信息。通過標準化比較分析確定miRNA的最終讀數。

1.3 生物信息學分析 使用GenePix pro V6.0 軟件進行相關數據分析，通過每個探針點獲得初始熒光強度值。標準化比較芯片之間的數據，重復芯片之間的數據分析，最終篩選出差異表達水平大于1.5或小于0.67倍的miRNA（P＜0.05）。將篩選出的差異表達的miRNA 利用targetscan 軟件進行靶基因的預測和分析。得出的靶基因通過david 網站進行基因功能詮釋和聚類分析、功能富集分析。

1.4 統計學分析 采用SPSS 19.0軟件處理，計量資料以x±s表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 差異表達miRNA 的篩選 根據miRNA 表達芯片的分析數據，初步結果發現54個miRNA 位點存在差異表達，其中上調28 個，下調26 個。結合相關文獻報道，我們選擇表達水平變化倍數R 在0.67～1.5 篩選差異表達的miRNA，篩選出差異明顯的4 個miR?NAs，其中顯著上調3 個，分別是miR-188-5p、miR-4284 及miR-5100；顯著下調1 個，為miR-6277-3p?；鹕綀D顯示明顯差異表達的miRNA（圖1）。

2.2 生物信息學分析 將上述差異表達的miRNA 分別在targentscan 網站上尋找靶基因，目標積分80 以上的靶基因及功能。將靶基因做交集分析后，得出相互交集的靶基因有7 個，分別為MEX3A、FBXL18，、FZD2、AAK1、KAT7、CACLR、PLA2R1。根據交集和靶標評分靠前的原則，鎖定25 個靶基因，經David軟件GO分析出前10個靶基因（表3）。這些基因主要參與細胞和酶的代謝、活化、轉運及感染和炎癥反應，具體包括X 染色體的激活、鋅指蛋白、鋅離子的結合、細胞內吞、蛋白代謝等。參考文獻后發現，某些鋅指蛋白和血管增生及新生血管形成有關，推測維吾爾族煙霧病發病可能和鋅指蛋白有一定的相關性。

3 討論

本文結果發現的miR-4284 是近年來新發現的miRNA，其表達水平上調可能預示頸內動脈狹窄。miR-4284 在下肢動脈硬化閉塞癥病人血漿和血管組織中均明顯上調，在缺氧缺血清誘導的主動脈平滑肌細胞中明顯下調，缺氧缺血清誘導的臍靜脈內皮細胞中明顯上調[4]。

本文結果顯示維族煙霧病病人miR-6722-3p表達下調。有研究報道煙霧病病人血漿hsa-mir-6722-3p和hsa-mir-328-3p的差異表達[5]，基因分析和傳導通路分析顯示在煙霧病發病過程中，可通過miRNA-基因表達網絡調節內皮細胞生物學功能。

表3 生物信息學分析篩選出的主要靶基因名稱及代碼

圖1 8例煙霧病差異表達miRNA的火山圖

鋅指蛋白含有短的我自折疊“指狀”結構，并通過與Zn2+結合而穩定。本文篩選出的靶基因中包含2 種鋅指基因，為ZFP91 和ZFP41，其中ZFP91 更值得關注，含有5個鋅指結構域，同時具有轉錄因子特征性結構基序[6]。Xu 等[7]報道ZFP91 是一種E3 泛素連接酶，負責Lys 185的hnRNP的泛素化以及蛋白酶體降解。此外，ZFP91 可以促進pro-IL-ip 的產生和IL-1P的分泌[8]。我們推測，某種鋅指基因（如ZFP91等）可能是維族煙霧病發病的靶基因，通過激活或抑制miRNA（如miR-188-5p 等），在煙霧病的炎癥反應過程或血管內皮增生過程中，起著某種促進作用，但具體作用機制需進一步深入研究。

總之，遺傳因素和環境因素可能通過復雜的機制在維族煙霧病發病中發揮重要作用。希望未來能制造出整合這些因素的煙霧病動物模型，進一步證實。此外，煙霧病相關基因miRNA等在循環血液中的變化僅特異性地累及頸內動脈系統，而全身其他血管卻不受累，這種現象目前還無法完全解釋。