GTPBP4基因沉默介導(dǎo)EGFR/PI3K/AKT信號通路對順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制

鄧淑文 夏紅星 (南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院疼痛科，衡陽 421002)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌晚期患者的5年生存率較低，因此研究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機(jī)制對尋找有效的治療方案十分重要[1,2]。人GTP結(jié)合蛋白4 (GTP binding protein,GTPBP4)是GTPBPs家族成員，主要位于人染色體10p15-p14區(qū)域，是長度為12 285的線性DNA序列，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)敲低GTPBP4基因表達(dá)能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞生長，GTPBP4在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[4,5]。Li等[6]關(guān)于胃癌的實(shí)驗(yàn)表明，GTPBP4在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)，通過調(diào)節(jié)p53活性促進(jìn)胃癌進(jìn)展。眾多信號通路與胃癌進(jìn)展相關(guān)，本研究進(jìn)一步探討GTPBP4與胃癌發(fā)病的關(guān)系，并探討其在胃癌中的具體調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人胃黏膜上皮細(xì)胞株和胃癌細(xì)胞株均購自中科院上海生命科學(xué)研究院；RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen；順鉑購自山東齊魯制藥；TRIzol試劑盒購自Gibco；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物；PCR引物序列由華大基因合成；BCA蛋白定量試劑盒購自Sigma；Western blot抗體購自Abcam；MTT溶液、Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自貝博生物；MTX-211 EGFR/PI3K/AKT通路特異性抑制劑購自Selleck。

1.2方法

1.2.1GTPBP4基因沉默及過表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建 采用NCBI查詢?nèi)薌TPBP4 mRNA序列(KJ8985 11.1)，BLOCK-iTTMRNAi Designer網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)GTPBP4的shRNA序列(5′-CACCGGATGTGCACAGTGATCAAGACGAATCTTGATCACTGTGCACATC-C-3′)。參照GenBank基因序列，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)GTPBP4引物(F：5′-TCGTTGATGTCTGTGAG-CTTC-3′，R：3′-GGTGCTTCTAGACAGTTGTTCA-5′)，并分別在上下游引物加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。經(jīng)酶切后連接至基因片段，轉(zhuǎn)至DH 5α大腸桿菌克隆，DNA試劑盒提取重組載體，-80℃保存。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染 將人胃癌細(xì)胞株MGC-803、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45及正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基。qRT-PCR和Western blot檢測各細(xì)胞株GTPBP4表達(dá)，篩選胃癌細(xì)胞中GTPBP4表達(dá)量最高的細(xì)胞株。……