miR-499a-5p通過靶向APC減輕氧化應激對心肌細胞損傷的研究

武國利 張寧 田蜜 田征 許金鵬 馬競 楊澤峰

【摘 ?要】目的：探討miR-499a-5p通過靶向APC減輕氧化應激對心肌細胞損傷的研究。方法：將H9c2細胞培養時使用含DMEM培養基（10 %胎牛血清）進行常規的培養、傳代，將正常培養的H9c2細胞標記為對照組，將其用H2O2（100、200、400、800μmol/L）處理4 h，檢測細胞的存活率，篩選400μmol/L的濃度建立氧化應激損傷模型，標記為模型組，比較兩組的心肌miR-499-5p表達及APC表達。結果：模型組miR-499-5p表達明顯低于對照組，而APC表達明顯高于對照組（P<0.05）。結論：miR-499a-5p可調控H2O2誘導的心肌細胞增殖、凋亡和氧化應激，其機制與靶向抑制APC有關，為氧化應激引起的心肌細胞損傷提供了新的治療靶點。

【關鍵詞】心肌細胞損傷;氧化應激;miR-499a-5p;APC

【中圖分類號】R197 ? ? ?【文獻標識碼】A ? ? ?【文章編號】1672-3783（2020）07-0108-01

氧化應激引起的心肌細胞凋亡是很多心臟疾病的重要作用機制，這也是心血管疾病治療的研究熱點。miRNA在人類疾病中的重要作用已經得到大量研究的認可，但是心血管疾病miR-499a-5p在心肌細胞損傷中的功能尚未完全清楚[1]。活化蛋白C（APC）是一種重要的生理抗凝劑，其由蛋白C介導的細胞途徑發揮直接的細胞調控，如抗炎活性、抗凋亡活性和內皮保護障礙。據報道，APC在缺血再灌注心肌損傷中具有有益作用，對心肌細胞凋亡和炎癥具有抑制作用[2]。但是，其與miR-499a-5p在心肌氧化應激損傷中的作用關系尚未清楚。本研究旨在探索miR-499a-5p在H2O2誘導的心肌細胞損傷中的作用及其與APC之間的關系，以期可為氧化應激引起的心肌細胞損傷的治療提供新靶點。

1.資料與方法

1.1一般資料 采用深圳市百恩維生物科技有限公司生產的大鼠心肌細胞H9c2，使用含DMEM培養基（10 %胎牛血清）進行常規的培養、傳代。將正常培養的H9c2細胞標記為對照組，將其用H2O2（100、200、400、800 μmol/L）處理4 h，檢測細胞的存活率，篩選400μmol/L的濃度建立氧化應激損傷模型，標記為模型組。

1.2miR-499a-5p、APC的表達檢測方法： 采用qRT-PCR檢測，收集細胞，將細胞用Trizol法提取細胞中的總RNA，再用反轉錄試劑盒將其合成cDNA。最后用qRT-PCR試劑盒操作，檢測細胞中miR-499a-5p、APC的表達。以U6、GAPDH為內參，2-△△Ct檢測細胞中miR-499a-5p、APC的相對表達量。20 μL逆轉錄反應混合物在42℃孵育15 min，加熱到95℃反應2min。qRT-PCR條件在95℃10 s，然后 95℃，5 s，60℃，30 s，72℃，1 min，45個循環。引物信息（5'-3'）：miR-499a-5p 上游引物5'-AACAUCACAGCAAGUCUGUGCU-3'，下游引物miR-499a-5p 5'-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3';U6上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3' ，下游引物5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3';APC上游引物5'-GGACTACAGGCCATTGCAGAA-3'，5'-GGCTACATCTCCAAAAGTCAA-3';GAPDH上游引物 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'[3]。

1.3統計學方法 應用 SPSS20.0 統計學軟件，計量資料用均數±標準差（ ±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為有統計學意義。

2.結果

2.1兩組miR-499a-5p、APC表達比較，見表1。

3.討論

miR-499-5p是進化上高度保守的肌肉特異性micro RNA，其在心室中的表達明顯升高。臨床研究表明，在心肌缺血缺氧或氧化應激狀態下，心肌細胞的miR-499表達發生改變，表現為miR-499表達降低，抵抗心肌細胞缺氧性損害。本研究結果顯示，模型組的miR-499-5p表達明顯低于對照組，而APC水平明顯高于對照組（P<0.05）。提示miR-499-5p可能參與心肌氧化應激的病理過程中，而APC過表達能逆轉miR-499-5p對心肌細胞的損傷[4]。

綜上所述，miR-499a-5p可調控心肌細胞的增殖、凋亡和氧化應激反應，臨床可通過靶向抑制APC，減輕氧化應激對心肌細胞損傷。

參考文獻

[1] 王曉景，張明星，陳小亮.miR-20a-5p通過靶向MRTFA緩解ox-LDL誘導的內皮細胞損傷[J].中國動脈硬化雜志，2019，27（9）：743-750.

[2] 王彥利，李紀明，羅進光.miR-137靶向下調SETD7表達對缺氧復氧誘導的心肌細胞氧化應激的影響研究[J].分子診斷與治療雜志，2019，11（6）：462-467.

[3] 吳麗夢，李恩，周小翠等.miR- 499-5p干預對心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].鄭州大學學報（醫學版），2018，53（5）：614-618.

[4] 崔瑞新，呂風華，岳瑩等.microRNA-499靶控的PI3K/Akt通路在大鼠缺血-再灌注心肌損傷中的作用[J].鄭州大學學報（醫學版），2016，51（6）：740.