葛根芩連湯對臨床產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌的抑制作用▲

環 誠 王小平 寇 靜 馮 昭

(陜西中醫藥大學醫學技術系，陜西省咸陽市 712046，電子郵箱：1318807324@qq.com)

大腸埃希菌是人的正常菌群中的常見條件致病菌。大腸埃希菌是醫院感染的重要致病菌之一,是革蘭陰性桿菌中有代表性的產超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)菌種之一，臨床上大腸埃希菌的耐藥性較嚴重[1-3]。大腸埃希菌對許多抗生素都具有耐藥性，目前，臨床上使用亞胺培南等碳青霉烯類抗菌藥物治療大腸埃希菌感染，但是此類抗菌藥物價格高昂，抗菌范圍廣，易導致菌群失調，因此僅適用于感染嚴重的患者[4]。

由于極少有細菌對中藥產生耐藥性[5]，臨床上中藥復方對耐藥細菌感染的治療效果相對西藥更具優勢。葛根芩連湯源自《傷寒論》，是東漢末年張仲景的經典名方。該方由葛根、黃芩、黃連、炙甘草4味中藥組成，具有輕清解肌、清熱止痢的功效，其在臨床上不僅可用于治療菌痢、輪狀病毒性腸炎、抗生素相關性腸炎、潰瘍性結腸炎、腸易激綜合征，還可用于治療糖尿病、高血壓等慢性疾病[6]。本實驗通過分析葛根芩連湯對產ESBLs的大腸埃希菌和不產ESBLs標準菌株的體外抑菌作用，探討葛根芩連湯是否可通過調整腸道或腸道外的菌群來發揮治療腸道感染的作用。

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器 MH營養瓊脂(批號：02-275)購自北京澳博星生物技術有限責任公司；營養肉湯(批號：02-013)購自北京澳博星生物技術有限責任公司；722E型可見分光光度計購自上海光譜儀器有限公司；9080型隔水式恒溫培養箱購自上海一恒科技有限公司；FA1104N型電子天平購自上海精密科學儀器有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海一恒科技有限公司；TS-100C型恒溫搖床購自上海天呈實驗儀器制造有限公司；BBS-SDC型潔凈工作臺購自濟南鑫貝西生物技術有限公司；YJT-1OO-I型托盤天平購自常熟市天量儀器有限責任公司；BCD-188K/ACJN型冰箱購自青島海爾股份有限公司；RT-2100C酶標分析儀購自深圳市雷杜電子有限公司；MLS-3780型全自動高壓滅菌器購自日本SANYO公司。

1.2 菌種來源 共4株菌株用于實驗。其中，兩株為臨床上的產ESBLs大腸埃希菌(臨床菌株1、臨床菌株2)，由陜西中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科提供，按照第4版《全國臨床檢驗操作規程》[7]進行分離培養，使用法國梅里埃公司 VITEK?2 Compact 全自動微生物分析系統進行菌種鑒定。另兩株大腸埃希菌標準菌株ATCC25922、ATCC35918購自溫州市康泰生物科技有限公司，前者為β-內酰胺酶陰性的標準菌株，后者為產β-內酰胺酶大腸埃希菌的標準菌株(含質粒編碼的TEM-1基因)。

1.3 實驗步驟

1.3.1 藥物預處理：將葛根、黃連、黃芩、甘草按復方比例5 ∶3 ∶3 ∶1混煎，使濃縮飲片復方的初始原濃度為2.21 g/mL(即每毫升含原藥材2.21 g)，高壓蒸汽滅菌備用。

1.3.2 制備細菌懸液：先將4株菌株接種于平板營養瓊脂培養基內，放置于37℃培養箱中培養過夜，記號筆標記。挑選培養16～20 h后單個生長狀態良好的大腸埃希菌菌落，接種于肉湯培養基中，放置于37℃恒溫搖床上震搖4 h。在分光光度計上600 nm波長位置測細菌的A值，A值保持在0.01左右。

1.3.3 微量二倍稀釋法測定最小抑菌濃度[8]：(1)稀釋藥液、加菌懸液。每株菌株均分為實驗組(5個濃度)、純藥組、純菌對照組、純培養基對照組，在96孔板上進行實驗。實驗組用二倍法稀釋藥液，將藥液濃度配置為原濃度以及原濃度的1/2、1/4、1/8、1/16，每孔加100 μL藥液后，再加入100 μL菌液，每孔菌液最終濃度為105CFU/mL。純藥組每孔加藥液100 μL和營養肉湯100 μL，純菌組每孔加菌液100 μL和營養肉湯100 μL，純培養基對照組每孔加營養肉湯200 μL，純藥組的濃度梯度和實驗組一樣。同時做3個平行組。(2) 測A值。將各組的96孔板放入酶標儀中，在600 nm波長下測每個孔的A值，記錄測定時間及A值，然后放入37℃的搖床上培養，每隔3 h測定1次A值，共測量4次，取3個平行組的平均值。A值隨著時間沒有變化的藥物最小濃度可以認定為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。(4)生長速度的計算：以時間作為橫坐標，以A值作為縱坐標，繪制折線圖，從每個折點圖中計算出每個曲線的斜率，即細菌生長速度。將各濃度實驗組與純菌對照組的生長曲線斜率進行對比，斜率大于純菌組時，說明該濃度的藥物可以促進細菌生長，斜率小于純菌組時說明該濃度的藥物可以抑制細菌生長。

1.3.4 涂平板法測最低殺菌濃度：搖床上連續震搖測完A值后(共9 h)，各組在96孔板(即1～8孔)上，用移液槍分別吸取50 μL/孔移到固體培養基上，用玻璃刮鏟涂抹均勻。將制作好的平板放入37℃的培養箱中，培養18 h后觀察結果。平板上低于5個菌落，可認定此濃度為最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。實驗重復3次取平均值。

2 結 果

2.1 葛根芩連湯對4株菌株的MIC及MBC 葛根芩連湯對臨床菌株1和2的MIC都是原濃度的1/2，對標準菌株ATCC35918的MIC最小，對標準菌株ATCC25922的MIC最大，即葛根芩連湯對于標準菌株ATCC35918的抑菌效果大于對標準菌株ATCC25922；葛根芩連湯對臨床菌株1和2的MBC分別是1/2原濃度和原濃度，而葛根芩連湯對兩株標準菌株均無MBC，即原濃度的平板培養后菌落數大于5個。見表1。

表1 葛根芩連湯對4株大腸埃希菌的MIC和MBC(g/mL)

注：“無”指沒有MBC；g/mL指每毫升含原藥材克數。

2.2 葛根芩連湯對臨床菌株及標準菌株生長速度的影響 原濃度至1/4原濃度的葛根芩連湯均可抑制產ESBLs的臨床菌株1和2的生長速度。原濃度至1/16原濃度的葛根芩連湯對產β-內酰胺酶標準菌株ATCC35918的生長都具有抑制作用；1/2原濃度至1/16原濃度的葛根芩連湯對標準菌株ATCC25922的生長反而具有促進作用，其生長速度快于純菌，即葛根芩連湯對兩種標準菌株的作用截然相反。見表2。

表2 不同濃度葛根芩連湯干預下4種大腸埃希菌的生長速度

注：純菌對照組中，臨床菌株1、臨床菌株2、標準菌株ATCC35918及ATCC25922的生長速度分別為0.0923、0.1282、0.1075、0.0945。

3 討 論

20世紀80年代，國內多項體外抑菌實驗結果表明，中藥對腸道細菌的體外抑菌效果不如西藥[9-10]。但其中大多數研究都是測定中藥的MIC，這對本身抑菌作用并不太強的中藥來說，意義并不大。然而，在臨床上我們發現中藥及中藥復方都有比較強的抗感染作用，有學者認為，中藥是通過調節人體的免疫系統來對抗病原微生物的感染[11]。近幾年，有關中藥針對細菌的直接作用研究較少，但隨著對微生態的了解和實驗方法技術的提高，中藥是否可以通過對菌群的調節作用來對抗各種感染引起了研究人員的重視，尤其是針對抗生素濫用導致的菌群失調情況下耐藥性細菌引起的機會感染。

葛根芩連湯單味藥葛根、黃連、黃芩、甘草中的有效成分都有抑菌和抗炎作用[12-13]。復方葛根芩連湯在臨床上被廣泛應用于治療腹瀉和腸炎，甚至糖尿病的足部感染。本研究應用微量二倍稀釋法和平板涂布法分別檢測MIC和MBC，主要觀察葛根芩連湯在體外對大腸埃希菌耐藥菌株和非耐藥菌株的抑菌作用是否有差異；同時，考慮到中藥粗提物本身有顏色，所以在測A值時采用動態測定。結果顯示，葛根芩連湯對產β-內酰胺酶大腸埃希菌(ATCC35918)的生長速度有明顯的抑制作用，而對非耐藥大腸埃希菌(ATCC25922)不僅沒有抑制作用，還提高了細菌的生長速度。這表明，葛根芩連湯有調節腸道菌群的作用，尤其是針對長期應用抗生素后的耐藥細菌的感染。為了進一步印證這個結論，我們觀察了葛根芩連湯對來自臨床的兩株產ESBLs菌株體外生長速度的影響，發現藥物濃度大的葛根芩連湯對兩株產ESBLs菌株都有明顯的抑制作用，說明葛根芩連湯可以通過調整腸道菌群的作用來治療耐藥菌感染。但當濃度變小時，葛根芩連湯對來自臨床的兩株產ESBLs菌株作用不明顯，并且作用效果不盡相同：原濃度的1/8和1/16葛根芩連湯對臨床菌株1的生長有促進作用，而對臨床菌株2有抑制作用。由于來自臨床產ESBLs菌株遺傳背景并不清楚，而臨床產ESBLs菌株的基因型有很多種，不同基因型的產ESBLs菌株對中藥的敏感性也不盡相同。

葛根芩連湯對臨床產ESBLs大腸埃希菌有較好的抑菌及殺菌作用，而對非耐藥大腸埃希菌的抑制作用弱。因此葛根芩連湯或可通過調整應用抗生素后出現的產ESBLs大腸埃希菌和非耐藥大腸埃希菌的菌群紊亂來治療腸道感染。在今后的研究中可以對不同基因型的產ESBLs菌株進行分型，以及對葛根芩連湯的有效成分進行分離研究，以探索葛根芩連湯對ESBLs菌株的作用機制。