轉染人附睪蛋白4基因對人卵巢癌細胞基因表達的影響

朱連成，郭騫，勾睿，劉娟娟，劉晴，林蓓

（中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

卵巢癌作為女性生殖系統常見的惡性腫瘤，其死亡率居女性惡性腫瘤之首，大部分患者發現時已經是晚期［1］，其原因包括早期轉移、早期診斷困難及化療耐藥等［2］。人附睪蛋白4（human epididymis protein 4，HE4），又名乳清酸性蛋白4-二硫鍵核心結構域2（WAP four-disulfide core domain protein 2，WFDC2），是通過基因組及蛋白質組學篩選獲得的卵巢癌腫瘤標志物，2008年被美國FDA指定為監測上皮性卵巢癌復發的血清標志物，其敏感性、特異性較高，近年來引起研究者廣泛關注［3-5］，然而大部分研究集中于早期診斷、判斷預后等臨床方面，關于其對卵巢癌惡性生物學行為影響的機制研究較少［6-9］。因此，本研究采用了基因芯片技術對轉染了HE4基因的卵巢癌細胞系及其對應的空質粒轉染組細胞進行基因表達序列分析，找到差異表達基因并對其進行基因和蛋白水平的驗證，本研究采用基因本體（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，初步探討與HE4相關的分子機制，以期為卵巢癌中HE4相關的機制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞培養、質粒構建及HE4基因轉染

人類上皮性卵巢癌細胞系ES-2購自美國ATCC，培養于含10%胎牛血清和1%盤尼西林/鏈霉素的RPMI-1640培養基，37℃恒溫，5% CO2加濕。全長人類HE4cDNA擴增 pEGFP-N1或者pCMV6質粒，引物如下：P1，5'-TCCGCTCGAGATGCCTGCTTGTCGCCT AG-3'；P2，5'-ATGGGGTACCGTGAAATTGGGAGTG ACACAGG-3'。轉染采用脂質體轉染試劑盒。細胞系分別標記為HE4高表達（HE4-H，O）和其對照空質粒轉染細胞（HE4-H-Mock，OV），見表1。

1.2 實時PCR驗證

TRIzol法分別提取各組細胞總RNA，SuperScriptⅢ反轉錄成cDNA。使用Roche LightCycler480進行實時PCR反應。HE4引物及內參GAPDH引物見表2?！?br>