CD14、MD-2在LPS致乳腺上皮細胞炎癥中的作用①

王萬林 高 月 謝雪艷 李天珍 易 瓊 王 魯

(貴州大學藥學院,貴陽 550025)

乳腺上皮細胞(mammary epithelial cells，MECs)主要作用是生乳，與免疫細胞不同。當LPS侵入時，其卻能做出免疫反應，分泌細胞炎性因子[1]。Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號通路已在先天免疫細胞如巨噬細胞和樹突細胞中得到充分體現[2]，白細胞分化抗原14(cluster of differentiation 14，CD14)、髓樣分化蛋白2(myeloid differential protein-2，MD-2)在免疫細胞的胞外LPS-TLR4炎癥信號傳導過程中發揮著巨大作用，LPS激活TLR4胞外信號通路，需要與LPS結合蛋白結合后傳遞給細胞膜上的CD14，再與MD-2相互作用將跨膜信號轉入細胞，激活免疫效應細胞進而誘發炎癥反應[3]，但是該過程在乳腺上皮細胞中未見報道。我們前期研究證明 MECs中有TLR4表達[4]，LPS促進MECs胞內的TLR4、MyD88、IRAK-1、TRAF6、TAK-1、NIK mRNA的表達[5]，抑制IκB mRNA的表達[6]，最終促進細胞分泌TNF-α和IL-8，說明MECs的TLR4胞內信號通路與免疫細胞是一致的。但是MECs胞外是否也存在CD14和MD-2蛋白，且是否發揮著免疫細胞相似的作用未見報道，因此本實驗體外培養小鼠MECs，分析該基因在小鼠MECs胞外LPS至TLR4信號途徑中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級昆明小白鼠購自解放軍第三軍醫大學實驗動物中心[動物許可證號：SCXK(渝)-2012-0011]。在貴州大學貴州省生化工程中心SPF級動物實驗室[動物許可證號：SYXK(黔) 2013-0001]飼養至妊娠中后期。

1.1.2主要藥物及試劑 胎牛血清(FCS)、DMEM/F12培養基、Ⅰ型膠原酶和Ⅱ型膠原酶購自Thermo scientific公司；rhEGF、霍亂毒素、胰島素、脂多糖(LPS)、異硫氰酸熒光標記FITC-LPS購自Sigma公司；L-谷氨酰胺購自SAB公司；MTT購自Solarbio公司；TIAN Script RT kit、RNA pure Tissue kit、2×Taq PCR Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司；Power SYBR Green PCR Master Mix購自AB公司；mouse TNF-α ELISA kit、mouse IL-1β ELISA kit、mouse IL-6 ELISA kit購自武漢基因美生物公司；Anti-CD14、anti-MD-2、抗anti-Rat IgG-Alexa 594、抗anti-Rabbit IgG-Alexa 488購自Abcam公司。

1.1.3主要實驗儀器 Thermo Nano Drop ND-2000微量紫外分光光度計、Multiskan Go型全波段酶標儀、Thermo Fisher 3111儲水型CO2細胞培養箱，Thermo公司；……