Toll樣受體與類風濕性關節炎的相關性及靶向防治的研究進展▲

周凡琦 冷 靜 運晨霞,3

(1 廣西中醫藥大學基礎醫學院，南寧市 530200，電子郵箱：1468749694@qq.com；2 廣西高發傳染病中西醫結合轉化醫學重點實驗室，南寧市 530200；3 廣西醫科大學研究生院，南寧市 530010)

【提要】 類風濕性關節炎(RA)是一種常見的慢性自身免疫性疾病，可導致關節腫脹、疼痛、活動障礙等。闡明RA的發病原因及發病機制，對于RA的診治尤為重要。研究表明，Toll樣受體在RA患者關節周圍的免疫細胞及滑膜細胞中的表達均有所改變，參與了RA的發生和發展，在RA的發病進程中扮演著重要作用。本文就Toll樣受體的表達模式、識別配體及其與RA的相關性，以及Toll樣受體靶向藥物在RA中的應用作一綜述，為進一步了解RA的發病機制提供參考。

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是較為常見的慢性自身免疫性疾病，病因多樣。RA的主要特征是手與腳的小關節呈向心性對稱發病，老年患者可能會波及遠端大關節，病程長者往往出現關節畸形，更為嚴重者可導致功能喪失[1]。但目前RA的發病機制尚未完全清楚。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種天然免疫識別受體，在先天性和適應性免疫反應中均起重要作用。TLR除了識別特定的病原相關分子模式外，還可以識別機體內部產生的損傷相關分子模式，而激活TLR信號通路可導致各種炎癥性因子表達升高。研究表明，TLR的異常表達、外源性或內源性配體對TLR通路的不當觸發可能導致自身免疫性反應和組織損傷[1-2]。因此，本文就TLR的表達模式、識別配體及其與RA的相關性，以及TLR靶向藥物在RA中的應用進行綜述，為進一步了解RA的發病機制及防治提供參考。

1 TLR的表達模式、識別配體及其與RA的相關性

TLR是Medzhitov等[3]從哺乳動物體內發現有與果蠅體內相似的Toll蛋白分子后命名的。隨著對TLR的不斷研究，學者們先后從人體中發現了10種TLR，分別是TLR1～10。其中，TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6、TLR10主要表達于細胞質膜表面，識別微生物的脂質、脂蛋白和蛋白質等；而其他TLR主要在細胞核內表達，識別微生物的核酸[4]。正常情況下，TLR主要表達在多種免疫細胞，如單核細胞/巨噬細胞、粒細胞、淋巴細胞、樹突狀細胞等[2]；而在疾病狀態下，TLR也表達在相應病變部位的內皮細胞或成纖維細胞上，介導炎癥反應。

1.1 TLR1 TLR1主要表達在淋巴細胞、單核-巨噬細胞、自然殺傷細胞、樹突狀細胞及中性粒細胞等細胞表面，通常和TLR2形成異源二聚體，主要識別三乙酰化脂肽及肽聚糖[5-6]，常與TLR2一起參與對微生物制劑的先天免疫反應。而在RA患者體內，TLR1也表達在RA患者關節的滑膜成纖維細胞、角化細胞和內皮細胞的細胞膜上[7]，但具體機制尚無文獻報告，推測TLR1同TLR2一起受外源性配體的刺激直接或間接引起了T細胞和B細胞的激活，從而參與RA的發生。

1.2 TLR2 TLR2主要表達在小膠質細胞、單核-巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B細胞和T細胞表面，常與TLR1或TLR6配對形成異二聚體的形式[5]，主要識別外源性的革蘭陽性菌的肽聚糖、胞壁酸以及非典型的脂多糖，也識別分枝桿菌的脂蛋白、錐形蟲的糖肌醇磷脂、真菌的酵母多糖，以及宿主體內產生的損傷相關分子模式(如熱休克蛋白等)[8]。臨床研究表明，TLR2可高度表達在與RA相關的滑膜組織系的巨噬細胞和成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)，以及RA患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)上，并且TLR2信號通路的活化可明顯誘導FLS的遷移和其對關節的侵襲，并促使細胞釋放基質金屬蛋白酶而引起關節的炎癥[8-9]。TLR2與其配體結合后，還可使RA患者FLS以及PBMC釋放白細胞介素(interleukin,IL)-6、IL-17等炎癥因子，導致關節軟骨炎癥和退化[10]。動物實驗研究表明，在大鼠或小鼠的關節內注射TLR2配體(如鏈球菌細胞壁片段)可誘導髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴性的炎癥和關節炎發生，此外，增加TLR2的表達也可以增強膠原蛋白誘導的RA[11]。這均表明細胞表面TLR2表達增加，或者受配體刺激后信號通路的活化，均可誘導炎癥因子的釋放，從而參與RA的發病過程。

1.3 TLR3 與其他TLR的表達模式不同，TLR3在胎盤和胰腺中表達最豐富，但僅限于表達在樹突狀細胞亞群上；而在其他組織中TLR3也可以表達在T細胞、自然殺傷細胞、粒細胞和單核細胞上[12-14]。TLR3主要識別的配體為病毒的雙鏈RNA以及壞死細胞釋放的內源性配體雙鏈RNA[15]。TLR3的信號通路與其他TLR不同，只有非依賴MyD88途徑，其使用β干擾素TIR結構域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor-inducing interferon-β,TRIF)作為唯一適配器，最終通過干擾素調節因子3和核因子κB信號通路的活化，誘導Ⅰ型干擾素的產生，在抗病毒感染中發揮重要作用[16]。

臨床研究顯示，RA患者在患病早期滑膜組織及關節的FLS上TLR3表達水平升高，這可能與RA患者滑膜中存在腸道菌群釋放的DNA和肽聚糖有關，這些成分的存在可導致TLR3的活化[17-18]。同時在RA患者關節中，壞死細胞釋放的內源性RNA也可作為配體激活TLR3信號通路，而活化的TLR3通路誘發產生腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、IL-1、IL-6、IL-17等炎癥因子，又能增加FLS中TLR3的表達，從而加重關節炎癥[19]。動物實驗研究表明，微小RNA-26a可抑制TLR3的表達，通過抑制TLR3信號通路的活化，使降植烷誘導的關節炎大鼠的癥狀得到緩解，目前微小RNA-26a已經成為與TLR信號傳導相關的炎癥性疾病的藥物治療靶點[20]。以上研究結表明，TLR3在RA發生、發展中均具有重要作用，而抑制TLR3信號通路可抑制關節的炎癥反應。

1.4 TLR4 TLR4主要表達在樹突狀細胞、單核-巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞及各組織器官的上皮細胞表面[21]。TRL4除了能識別外源性病原相關分子模式，如革蘭陰性菌的LPS、呼吸道合胞病毒F蛋白、透明質酸寡糖外，也可以識別宿主細胞內的損傷病原相關分子模式，如熱休克蛋白60/70、硫酸肝素蛋白多糖成分以及纖粘連蛋白和纖維蛋白原[22]。臨床研究結果顯示，TLR4與RA的發病密切相關，在RA患者的PBMC以及滑膜組織/滑液中抗原呈遞細胞表面的TLR4表達水平均升高；TLR4受配體刺激后可產生大量的細胞因子，啟動機體的炎癥反應最終導致關節組織和骨組織的破壞[23-25]。體外研究也表明RA滑膜細胞或巨噬細胞受到脂多糖刺激后，TLR4相關信號通路即核因子κB、絲裂原活化蛋白激酶等炎癥信號通路活化，從而導致炎癥因子大量釋放，引起關節滑膜的炎癥；而抑制TLR4信號通路可有效抑制TNF-α、IL-1、IL-6的分泌[26]。此外，在TLR4基因缺乏的小鼠中，Ⅱ型膠原蛋白誘導的關節炎的發病率低，關節炎的嚴重程度降低[27]。由此可見，TLR4在RA的發生發展中也發揮了重要作用。

1.5 TLR5 TLR5主要表達在髓源性細胞，如單核-巨噬細胞，其識別的配體主要是細菌鞭毛，以及RA患者關節FLS產生的內源性配體[28-29]。研究表明，來源于RA患者單核-巨噬細胞和滑膜組織上皮細胞的TLR5表達比健康對照組更高[27]。研究發現，TLR5不僅調節RA單核細胞中的TNF-α的表達，而且TLR5的表達水平與TNF-α的產生以及RA疾病的嚴重程度評分密切相關[26]。因此，有效靶向調控TLR5有可能降低TNF-α的表達并降低RA嚴重程度。

1.6 TLR6 TLR6主要表達在小膠質細胞、單核-巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、B細胞和T細胞等表面，易與TLR2形成異源二聚體，其識別與TLR2相同的外源性配體，如革蘭陽性菌的胞壁酸、真菌的酵母多糖及支原體的二脂酰脂肽和一部分TLR2的內源性受體[30]。盡管TLR1、TLR2和TLR6有相同的表達模式，但在B細胞表面TLR1和TLR6比TLR2表達的更多[31]，但是目前尚未發現TLR6在RA中的作用。

1.7 TLR7與TLR8 TLR7與TLR8的作用極其相似，但表達部位不同。TLR7主要是表達在抗原提呈細胞，包括單核-巨噬細胞、樹突狀細胞及B細胞表面；而TLR8主要表達在髓系細胞上，如單核細胞、巨噬細胞和髓系樹突狀細胞[32-33]。TLR7和TLR8識別的配體主要以病毒單鏈RNA為主，也可識別咪唑喹啉化合物。研究表明，TLR7和TLR8都可表達于RA滑膜組織內膜、滑膜巨噬細胞以及FLS表面，并且經炎癥因子IL-17和IL-8刺激后TLR7的表達水平可增加，而經脂多糖LPS和IL-1刺激后TLR8的表達水平亦可增加，從而加重RA的炎癥反應[34]。動物實驗研究表明，建立膠原誘導的RA小鼠模型后，體內TLR7遺傳缺失小鼠的關節炎癥明顯輕于TLR7表達正常的小鼠[35]。這些研究均揭示了TLR7和TLR8在RA發病過程中的潛在作用。

1.8 TLR9 TLR9主要表達在漿細胞樣樹突狀細胞、記憶性B淋巴細胞等免疫細胞及腸上皮細胞、肺泡上皮細胞和角質形成細胞非免疫細胞的胞內內膜上[36]。其主要識別細菌或病毒非甲基化的脫氧胞苷酸磷酸鹽-脫氧鳥苷酸DNA。研究表明，通過抑制RA模型鼠TLR9的表達可以緩解RA疾病的嚴重程度，這表明過度表達的TLR9可以導致RA的疾病進展[37]。

1.9 TLR10 TLR10只表達在人而不表達在嚙齒類動物的免疫細胞上，以B細胞表達最多[38]。TLR10可以與TLR2形成異源二聚體，因此可以對TLR2識別的配體產生反應[39-40]，但是對于TLR10本身的配體和功能目前尚未進一步研究[41]。

2 TLR靶向藥物在RA中的應用

鑒于TLR在RA中的作用，很多TLR的拮抗劑正在被研發或已用于RA的臨床治療。

2.1 OPN-305和OPN-301 兩者是人源化的單克隆抗體，是TLR2的拮抗劑，能夠阻斷TLR2/1和TLR2/6介導的信號轉導。研究表明， OPN-305和OPN-301可阻斷體外培養的RA滑膜組織中 TLR2信號通路，可以有效抑制RA患者體外培養物分泌炎癥因子，并能抑制 RA 滑膜成纖維細胞的遷移和侵襲[42]。這為臨床防治RA提供了治療基礎。

2.2 NI-0101 NI-0101是阻斷TLR4的第一代人源性單克隆抗體，可與TLR4的配體決定部位結合，干擾TLR4二聚化，從而抑制TLR4通路的活化。目前用于急慢性炎癥、自身免疫疾病的臨床前研究[43]。此外，NI-0101目前正在開發用于RA的治療，具有個體化用藥的潛力[44]。

2.3 CU-CPT8m分子和CPG-52364 CU-CPT8m分子可抑制TLR8的活性，而對其他TLR幾乎沒有任何影響；復合抑制劑CPG-52364是選擇性TLR7/8/9拮抗劑，目前這兩者還處于臨床前研究。研究表明，CU-CPT8m可以有效地降低骨關節炎患者滑膜細胞產生IL-1β、TNF-α等炎癥因子的水平，這表明作為TLR8抑制劑，CU-CPT8m分子具有成為抗炎藥物的潛力[45]。動物實驗顯示，復合抑制劑CPG-52364對系統性紅斑狼瘡等自身免疫疾病具有抑制作用，目前正在進行一期臨床實驗[46]。因此，CU-CPT8m分子、復合抑制劑CPG-52364有望成為靶向治療RA的潛力藥物。

2.4 羥基氯喹 羥基氯喹是TLR7/9的抑制劑，臨床上廣泛用于治療瘧疾和RA。羥基氯喹可顯著抑制CpG誘導的IL-6和TNF-α分泌，其機制是通過抑制TLR9介導的B細胞功能；同時其也能拮抗TLR7和TLR8[47]。研究表明，羥基氯喹聯合中藥獨活寄生湯或甲氨蝶呤治療可明顯降低 RA患者體內的炎性因子水平，能夠顯著緩解 RA 病情，改善關節活動[48-49]。

2.5 CpG-c41分子 動物實驗表明，CpG-c41分子可通過競爭性結合TLR9受體阻斷其誘發的炎癥反應，同時還能交叉干擾脂多糖誘發的TLR4信號通路，抑制IL-6的分泌[50]，可為未來臨床RA的防治提供治療基礎。

3 展 望

隨著對TLR研究的不斷深入，TLR的來源、結構、配體、信號通路及生物學功能逐漸被認識。了解每一種TLR及其在炎癥中的作用，將有利于我們對RA發病機制的進一步了解，也可以為RA的防治提供更多的思路。