液相-原子熒光（LC-AFS）聯用技術測定大蒜中不同形態硒化合物含量研究

□ 鐘銀飛 安徽省產品質量監督檢驗研究院

1 前言

硒是14種人體必需微量元素之一，具有一定的營養作用。另一方面，硒過量攝入會引起人體中毒。同時，不同形態硒直接影響食品的營養價值和安全性，因此對形態硒化合物進行研究測定具有重要意義[1]。本文以大蒜為代表檢測樣品，對流動相濃度、pH值、流速以及在線紫外消解條件進行研究，優化液相—原子熒光（LC—AFS）聯用技術檢測硒代胱氨酸、亞硒酸跟、硒代蛋氨酸3種形態硒的條件，確定了最佳檢測條件[2]。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

SA720原子熒光形態分析儀、pH酸度計、氮吹儀、純水機與電子天平。

2.2 試劑

亞硒酸根標準溶液（GBW10032，購于中國計量科學研究院）：濃度為68.9 μg/g，以亞硒酸根計。

硒代胱氨酸標準溶液（GBW10087，購于中國計量科學研究院）：濃度為93.5 μg/g，以硒代胱氨酸計。

硒代蛋氨酸標準溶液（GBW10034，購于中國計量科學研究院）：濃度為97.9 μg/g，以硒代蛋氨酸計。

流動相：稱取6.8 g優級純磷酸氫二銨，溶解于一級水，定容于1 000 mL，用氨水調節pH值為6.0，配制成60 mmol/L的磷酸氫二銨溶液。

還原劑：2.0%KBH4（m/v）+0.5%KOH（m/v）+0.4%KI（m/v）；載流：15%鹽酸（v/v）。

2.3 色譜條件及熒光條件

色譜柱：PRP—X100陰離子交換柱（250 mm×4.0 mm）及保護柱（25 mm×4.0 mm）；流動相：60 mmol/L磷酸氫二銨溶液，流速1.2 mL/min，進樣體積200 μL。熒光條件：倍增管高壓：280 V；燈電流：50/50 mA；爐溫：280 ℃；載氣：300 mL/min；屏蔽氣：600 mL/min；在線紫外消解[3]。

2.4 標準曲線的繪制

將3種形態硒標準物質，用一級水溶解定容到棕色容量瓶中，分別配制成標準溶液母液。臨用前，用移液器移取一定量的3種形態硒標準溶液用二次去離子溶解定容到棕色容量瓶中配制成系列溶度的標準溶液，濃度分別為硒代胱氨酸145、290、435、580 μg/L 和 725 μg/L， 亞 硒 酸 根 43、86、129、172 μg/L 和 215 μg/L，硒代蛋氨酸 119、238、357、476 μg/L與595 μg/L。依次進樣，繪制成標準曲線（需當天配制）。

2.5 樣品前處理和檢測

稱取粉碎后的大蒜樣品5 g于50 mL離心管中，向樣品中加入15 mL甲醇水（1∶2）溶液，渦旋混勻，超聲提取20 min，離心10 min（8 000 r/min），離心后將上清液轉移至10 mL比色管中；重復上述步驟，合并上清液，氮吹濃縮，將濃縮后的溶液加一級水定容至10 mL，過0.45 μm濾膜備用，標準溶液進樣完成后上機檢測。

2.6 計算

按式（1）計算試樣中各種形態硒的含量。

C=(A×V×D)/(W×1000) （1）

式（1）中：C為形態硒含量，單位mg/kg；A為測得樣液中濃度，單位μg/L；V為樣液定容體積，單位mL；W為樣品稱量，單位g；D為稀釋因子。

3 結果與討論

3.1 色譜分離情況

硒代胱氨酸保留時間2.6 min、亞硒酸根保留時間4.4 min、硒代蛋氨酸保留時間6.0 min，3種形態硒標準溶液的分離色譜圖詳見圖1。

3.2 檢測條件的優化

3.2.1 流動相濃度

以40～80 mmol/L濃度范圍的磷酸氫二銨溶液為流動相，考察流動相濃度對形態硒分離和響應值的影響。當濃度小于50 mmol/L時，3種形態硒保留時間延長且峰形展寬；當濃度大于50 mmol/L時，3種形態硒保留時間保留時間變短；當濃度大于60 mmol/L時色譜峰重疊，分離度變差；當濃度為60 mmol/L時3種形態硒能夠在8 min內實現有效分離。

3.2.2 流動相pH

圖1 硒代胱氨酸、亞硒酸跟、硒代蛋氨酸等三種形態硒標準溶液分離色譜圖

配制60 mmol/L磷酸氫二銨溶液流動相，用氨水調節pH值為4.5～6.5，考察不同pH對3種形態硒分離效果的影響。實驗表明，當pH值降低，保留時間減少，當pH值小于5.0時，3種形態硒不能達到有效分離；當pH值增加時，保留時間增加，當pH值大于6.0后峰形變寬，靈敏度下降；當pH值為6.0時，3種形態硒能夠實現有效分離。

3.2.3 流動相流速

設定流速為0.8、1.0、1.2 mL/min和1.4 mL/min進行實驗，發現流速小于1.0 mL/min時，保留時間較長，峰形展寬；當流速大于1.2 mL/min后，保留時間減少，當分離度下降；當流速為1.2 mL/min時，能夠在8 min內實現有效分離，分離度較好。

3.2.4 在線紫外消解

直接激發除亞硒酸根外，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的有機硒響應信號非常低，當開啟在線紫外消解功能后，有機硒響應信號顯著上升，所以在形態硒檢測過程中需要保證在線紫外消解效果。

3.3 方法的線性及檢出限

配制不同濃度的標準溶液，在上述實驗條件下找出線性范圍。實驗證明：硒代胱氨酸在60～720 μg/L時，峰面積與濃度呈良好的線性關系，峰面積A與濃度C的線性方程為C=2 600.240A—102 939.151，相關 系 數為0.997，檢出限為60 μg/L；亞硒酸根在10～210 μg/L時，峰面積與濃度呈良好的線性關系，峰面積A與濃度C的線性方程為C=13 536.850A+36 463.015，相關系數為0.999，檢出限為10 μg/L；硒代蛋氨酸在55～590 μg/L時，峰面積與濃度呈良好的線性關系，峰面積A 與濃度C的線性方程為C=1 101.099A—46 290.586，相關系數為0.999，檢出限為55 μg/L。

3.4 方法的精密度及回收率

以大蒜為代表樣品，添加一定量的標準物質做陽性樣，按上述方法進行檢測，連續進樣測定8次，測定其精密度RSD，并加人適量標準溶液測定其回收率，結果見表1。

由上表可知，大蒜中硒代胱氨酸、亞硒酸根和硒代蛋氨酸的檢測精密度分別為1.5%、2.8%和1.0%，回收率分別為85.3%、89.8%和83.2%，該方法具有良好的精密度和加標回收。

表1 大蒜中樣品中硒代胱氨酸、亞硒酸根和硒代蛋氨酸含量測定