紅曲霉液態發酵產色素條件優化

□ 郭 航 吉林工程職業學院 糧油食品學院

紅曲霉（Monascus purpureus Went.）又叫紅曲、紅糟、紅大米，廣泛存在于樹木、土壤和堆積物等。紅曲色素是以紅曲霉為原料通過現代科技手段提取的一種天然色素，具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、抑制突變等功效。在食品工業被廣泛應用于肉制品、調味品、腌制品、酒類及焙烤類食物中。近年來，紅色食用色素如甜菜紅、紅曲紅和胭脂紅被允許添加到食品中。相對甜菜紅和胭脂紅，紅曲紅色素可用發酵法生產，通過優化菌種發酵條件使其產色素量增加，使紅曲紅色素的開發利用前景更為廣闊。

1 材料與方法

1.1 材料

葡萄糖、玉米粉、NaNO3、大豆粉、 尿 素、K2HPO4、FeSO4、KCl、MgSO4·7H2O、瓊脂、乳酸、甘油、L—谷氨酸鈉、無水乙醇、NaCl與紅曲霉。

1.2 儀器與設備

霉菌培養箱（MJP—150）、顯微鏡（XSZ—480AT）、 電 熱 恒 溫 水 浴鍋（DK—8B）、定時雙向磁力攪拌器（JB—1）、恒溫培養振蕩器（HZQ－R）、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG—9140A）、高壓滅菌鍋（YXQ—LS—30S）、阿貝折光儀（BM—2WAJ）、超聲波細胞破碎儀（NJL07—5）、分光光度計（722s）、低速離心機（TG—16—WS）和超凈工作臺（ZHJH）。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

1.3.1.1 種子培養基

玉米粉5%、NaNO33%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 1.5%、pH5.4，高壓蒸汽滅菌15 min（0.1 MPa）。從固體斜面培養基上取適量的紅曲霉菌種，添加到種子培養基中。裝液量100 mL，搖床震蕩培養，30 ℃，170 r/min，培養7 d。

1.3.1.2 紅曲霉液體培養基

葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 用 乳酸將 pH調為5.4，高壓蒸汽滅菌15 min（0.1 MPa）。

1.3.2 紅曲霉液態發酵產色素實驗

在紅曲霉培養基配方研究的預實驗中發現碳源、氮源、pH值、甘油和L—谷氨酸鈉顯著影響紅曲霉產色素。因此，選擇研究碳源、氮源、pH值、甘油和L—谷氨酸鈉這5個因素作為研究對象進行單因素實驗，確定最終的培養基配方。

實驗條件：30 ℃，170 r/min，搖床震蕩培養，每24 h測定一次吸光度，進而判斷出紅曲霉的色素產量，直到吸光度值不再增加。

1.3.3 發酵液色價的測定

吸取發酵液1 mL加入裝有9 mL 75%乙醇溶液（pH6.0～7.0）的試管中，搖勻，靜置15～20 min。移液管吸取1 mL上清液到另一試管中，加入9ml 75%乙醇溶液稀釋，用75%的乙醇溶液作為空白對照，用1 cm比色皿分別在410 nm和510 nm下測定吸光值（A）值。若吸光值小于等于0.8則吸光值乘以發酵液的稀釋倍數即為發酵液的色價（U/mL），若吸光值大于0.8，則分光光度計測量出的數據不準確，需要對發酵液進行進一步的稀釋再測量，直至吸光值小于等于0.8，吸光值乘以發酵液的稀釋倍數即為發酵液的色價（U/mL）[1]。

2 結果與分析

2.1 碳源對紅曲霉產色素的影響[2]

選擇NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，用乳酸將pH調為5.4，改變碳源，分別添加玉米粉3%、葡萄糖3%、淀粉3%、麥芽糖3%，并進行色價測定，結果如圖1所示。

圖1 碳源對紅曲霉產色素影響圖

由圖1可知，使用玉米粉作碳源時，紅曲霉產色素量最大，顏色深；使用淀粉時，紅曲霉產色素量較大，顏色較深；當使用麥芽糖和葡萄糖作為碳源時，紅色素產量低并且產色素慢。因此，葡萄糖和麥芽糖不是紅曲霉的良好碳源，培養紅曲霉時應盡量選用玉米粉或者淀粉作為紅曲霉的碳源。紅曲霉能良好的利用玉米粉的原因是玉米粉含有某些天然物質，有利于紅曲霉的生長[3—4]。由此分析，玉米粉和淀粉是紅曲霉的良好碳源，培養紅曲霉應選用玉米粉或淀粉，考慮到成本，最終選擇玉米粉。

2.2 氮源對紅曲霉產色素的影響

選擇葡萄糖3%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，用乳酸將pH調為5.4，改變氮源，分別添加NaNO30.2%、大豆粉0.2%、NaNO30.2%、尿素0.2%，并進行色價測定，結果如圖2所示。

由圖2可知，使用大豆粉作為氮源，紅曲霉產色素最高，色素的顏色深；使用尿素作為氮源，紅曲霉幾乎不產色素，培養基的顏色幾乎不變，可以推斷出紅曲霉不能以尿素作為氮源[5]。由此可以推斷，紅曲霉易于利用有機氮，利用有機氮產生的紅曲色素要多于利用無機氮產生的紅曲色素[6—7]。即利用大豆粉產生的色素多于NaNO3。尿素在酸、堿、酶的作用下（酸、堿需加熱）能水解生成氨和二氧化碳，二氧化碳不能被異養微生物利用。因此在氮源的選擇上，大豆粉是紅曲霉的良好氮源，培養紅曲霉應選擇大豆粉作為氮源。

2.3 pH對紅曲霉產色素的影響

選擇葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 改 變pH，分別為3.0、3.8、5.8、7.0與7.6，并進行色價測定，結果如圖3所示。

由圖3可知在pH值為3.8時培養紅曲霉，紅曲霉產色素最大，色素顏色最深；在pH值7.6時培養紅曲霉，紅曲色素產量較低，色素顏色很淺。由此可以看出，紅曲霉宜在偏酸性的環境中生長。

圖2 氮源對紅曲霉產色素影響圖

圖3 pH對紅曲霉產色素影響圖

圖4 甘油添加量對紅曲霉產色素影響圖

2.4 甘油對紅曲霉產色素的影響

選擇葡萄糖3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 用 乳酸將pH調為5.4，改變甘油添加量，分別添加1%、2%、3%、4%和5%，并進行色價測定，結果如圖4所示。

由圖4可知，適當添加甘油可以增加紅曲霉色素的產量。當甘油的添加量為2%時，紅曲霉產色素量最多，色素的顏色最深。當添加量大于或者低于這個值時，紅曲霉產色素量都會受到一定的影響。甘油添加量過多后，可能會影響培養基的pH值，偏離紅曲霉菌株的最適pH值，產色素量降低。因此，在保證培養基的其他條件都適合紅曲霉菌生長的情況下，添加2%的甘油有利于紅曲霉產色素。

2.5 L-谷氨酸鈉對紅曲霉產色素的影響

選擇葡萄糖 3%，NaNO30.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%， 用 乳酸將pH調為5.4，改變L—谷氨酸鈉添加量，進行試驗，分別添加0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%L—谷氨酸鈉，并進行色價測定，結果如圖5所示。

圖5 L-谷氨酸鈉添加量對紅曲霉產色素影響圖

由圖5可知，L—谷氨酸鈉的添加量為0.1%時，紅曲霉產色素量最大。原因可能是，谷氨酸鈉添加到培養基中可以分離出Na+供紅曲霉菌株利用。當L—谷氨酸鈉的添加量超過0.1%時，紅曲霉產色素量下降。這是由于當添加過多的L—谷氨酸鈉時，會導致培養基的酸堿度呈中性或者偏堿性，不適于紅曲霉菌株生長，生長緩慢，產色素量降低。因此，選擇向培養基中加入0.1%的L—谷氨酸鈉。

3 結論

本文對紅曲霉液態發酵產色素培養基進行優化，結果表明玉米粉3%，大豆粉0.2%，K2HPO40.1%，FeSO40.001%，KCl 0.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH為3.8，甘油2%，L—谷氨酸鈉0.1%，培養7～8天，紅曲霉產色素最佳。培養基呈深紅色，在510 nm下的色價為4.06 U/mL。