桿菌細胞形變的機制與功能

王蕾，鄒琳，李夢潔，侯琳琳，陳小明，劉偉，孫桂芹，陳力

1. 復旦大學基礎醫學院醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室，上海 200032； 2. 浙江省水利水電裝備表面工程技術研究重點實驗室， 浙江 杭州 310024； 3. 浙江中醫藥大學醫學技術學院， 浙江 杭州 310053

細胞是生命的基本單元，顯微鏡下觀察到的細胞形態是細胞最重要的生物學特征。細菌是無核單倍體的單細胞生物，顯微鏡下其基本形態有球形、桿狀、弧形和螺旋形。研究發現，細菌基本形態之間存在相互轉化的特定機制。在合適的生長條件下，細菌合成新的染色體，經細胞分裂產生新的單細胞。新生細胞間的連接方式如雙球、八疊、成鏈等，是細菌細胞形態的另一個主要特征。此外，細菌的形態還受培養條件、生存環境及宿主免疫特異性組分功能和活性的影響。細菌形態是細菌主要分類及臨床診斷的依據，由基因組、基因組表達譜及其他環境因素共同決定。在特定環境及生理條件下，細菌細胞具有形變能力。細菌雖小，其獨立的生命活動卻不容忽視。其在代謝過程中產生抗生素、維生素等多種代謝產物，可為人類生產、生活和醫療衛生利用。因此，細菌細胞形變研究對臨床抗生素用藥指導及新型抗生素研發和生產有重要意義。

1 細菌基本形態的轉變

細胞形態是細菌分類與鑒定的重要參數。根據細菌細胞在顯微鏡下的形狀，細菌可分為球菌、桿菌、弧菌和螺菌四大類[1]。球菌的外觀呈圓形或類球形，直徑約1 μm。桿菌的基本形態為直桿狀，菌體兩端多呈鈍圓形。桿菌可細分為小桿菌(菌長 0.6～1.5 μm，如布魯桿菌)、中桿菌(菌長2～3 μm，如大腸埃希菌)和大桿菌(菌長3～10 μm，如炭疽芽胞桿菌)。菌體呈弧形彎曲的弧菌和呈螺旋狀的螺菌也較為常見，其中弧菌菌體總長2～3 μm，螺菌菌體總長3～6 μm[2]。L型細菌和芽胞是兩種特殊的細菌形態。細菌形成球形、桿狀、弧形還是螺旋形的分子機制一直是微生物學領域的焦點之一。

1.1 桿狀與球形之間的轉變

研究表明，決定細菌形態的分子可能參與細菌分裂過程[3]。 Ogura等于1989年分離得到桿菌變為球菌的突變株，發現該突變出現在青霉素結合蛋白2(penicillin-binding protein 2，PBP2)上[4]。后續研究表明，由PBP蛋白功能缺陷導致的肽聚糖結構改變可引起細胞形態發生變化[5]。2001年，Jones等發現枯草芽胞桿菌中MreB蛋白的缺失突變導致了細菌從短棒狀變成球形[6]。這一現象在大腸埃希菌中也得到了驗證[7]。mreB基因突變的球形菌中，染色體分離受到影響，出現了染色體缺失的球狀體[8]。結果提示，MreB蛋白與細菌染色體分離相關[9]。Wachi等發現MreB蛋白的抑制劑A22能快速干擾MreB蛋白的多聚化和胞內定位，導致細菌桿狀形態丟失甚至死亡[9-10]。后續研究發現，形成多聚體的MreB蛋白沿著細胞內壁呈圓周運動，調控細胞壁生長的空間位置來控制細菌的形態[11-14]。以上研究表明，MreB蛋白是細菌形態建立、維持和調控過程中的關鍵因子之一[15]。

1.2 弧形與桿狀之間的轉變

弧形細菌可在一定條件下轉變成桿菌。2003年，Ausmees等發現單基因creS的突變不影響細菌生長，但可使在平臺期生長的弧狀新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)變成長絲狀的桿菌[16]，并于2009年再次發現表達單基因creS就能導致大腸埃希菌呈弧形生長[17]。此外，2017年Bartlett等發現霍亂弧菌(Vibriocholerae)的CrvA蛋白突變可導致桿狀形變，是重要的致病因子[18]。研究發現，CreS或CrvA在外周質空間中均呈不對稱分布，均僅在單側存在，調控定位一側的生長速度而導致曲面形成[17-18]。

1.3 螺形的轉變

螺形菌幽門螺桿菌的形態突變體中，csd1基因突變引起弧形改變，csd4基因引起桿狀改變，csd3基因突變導致多種變形，菌體形態的改變影響了細菌在小鼠體內的定植[19-20]。生物信息學預測和體外實驗表明，csd1可能編碼肽聚糖內肽酶，csd4編碼的蛋白具有肽聚糖羧肽酶活性[21]，csd3基因也可能編碼肽聚糖內肽酶[19]。以上結果提示，菌體彎曲和螺旋的產生可能是基于肽聚糖的交聯程度。

1.4 L型細菌

L型細菌或細胞壁缺陷型是指細胞壁受損但仍能生長和分裂的一類特殊形態的細菌。由于肽聚糖缺失，細菌呈大小不一的球形、桿狀或絲狀等形態[2]。1935年，Klienberger首次報道了念珠狀鏈桿菌的L型菌體，發現其菌落和形態與支原體相類似[22]。雖然自然條件下出現L型細菌的機制并不清楚，但已知培養時持續阻斷和抑制細胞壁合成及保持培養基與細胞質等滲，是穩定誘導L型細菌形成的兩個要素[23-24]。研究表明，與正常細菌相比，L型細菌可能不依賴分裂中板的形成，可經不對稱擠出-分離的方式完成增殖[25]。臨床研究中，Beaman在接種了諾卡菌的小鼠肺中觀察到了L型細菌[26-27]。2001年，Woo 等研究發現，造血干細胞移植手術后的患者在免疫抑制期間有被L型細菌感染的風險[28]。隨后2005年研究發現，在使用以細胞壁為靶點的抗生素(如β-內酰胺類)治療過程中，會出現導致慢性感染的L型細菌[29]。此外，缺失細胞壁成分可能有利于細菌獲得耐藥性[29]。2015年，Kawai 等的研究結果表明，細胞壁合成被阻斷時發生的代謝失衡生理補償對L型細菌的增殖至關重要，為針對細菌細胞壁的抗生素的作用模式提供了新見解[30]。

1.5 芽胞

芽胞是細菌在嚴酷環境中產生的一種休眠狀態[31]，在營養極度缺乏的條件下形成[32]。芽胞的形成由一個特殊的細胞分裂和分化過程組成。以枯草芽胞桿菌為例，在特殊的分裂過程中，經不對稱分裂形成前芽胞和母菌。在分化過程中，經歷以下幾個階段：芽胞包皮質層的形成、芽胞外衣的生成、芽胞的脫水與成熟、母細菌程序性死亡后芽胞的釋放[33]。根據分裂和分化的結果，芽胞在菌體中的位置主要有3種類型：極端、中間和次極端。有關芽胞分化的分子機制研究，請參見相關綜述[32]。

2 桿菌絲狀形變的分子機制

細菌的形變可分為基本形態間的轉變和基本形態內的變形。研究表明，桿菌絲狀形變表型的出現與細菌細胞周期控制點的失控有關。細菌的細胞周期包括3個過程：細菌的生長(G期)、染色體的復制分離(S期)和細胞分裂(D期)。其中，細胞分裂由分裂中板的形成和菌體的分離兩個步驟構成[34]。細胞對每個過程完成的質控點被定義為細菌細胞周期控制點，其主要功能是阻止下一個過程的發生。

研究表明，S期過程受阻可導致細菌發生絲狀形變，該形變被稱為SOS絲狀形變[35-36]。SOS之所以會誘導出細菌的絲狀形變，是因為SOS誘導后產生的細胞分裂抑制蛋白SulA可特異性地與細胞分裂蛋白FtsZ單體結合，從而抑制FtsZ的多聚化[37-40]，導致細菌正常分裂所需的“Z環”不能在分裂中板有序進行[41]。胞內SulA蛋白表達在轉錄水平受轉錄因子LexA負調控，在蛋白水平受蛋白酶Lon負調控。胞內DNA受損導致LexA蛋白降解，由此啟動SulA蛋白表達，抑制細胞分裂的發生[42]。當染色體DNA損傷修復完成后，SulA蛋白被Lon蛋白酶降解，細菌分裂過程可重啟[43]。因此，SOS絲狀形變的關鍵調控因子是SulA蛋白。

細菌的染色體復制完成后，細菌進入分裂階段。分裂過程中關鍵步驟的突變可阻止細菌進入正常生長過程，可能導致絲狀及其他形變。分裂蛋白FtsZ是中板形成的核心蛋白，能招募下游的其他蛋白形成分裂復合物來完成二分裂。研究發現，胞內FtsZ蛋白的濃度至關重要。FtsZ低表達或缺陷導致細菌分裂受阻，發生絲狀形變；而FtsZ高表達則會導致“小細胞”產生。研究表明，分裂復合物中蛋白的協調作用也非常重要，整個過程需要準確的調控[44]。FtsZ/FtsA蛋白的濃度比發生異常會阻斷細菌的正常分裂，形成絲狀細菌[45-47]。其他分裂復合物蛋白發生突變或異常也可能導致細菌的(長)絲狀形變[48-49]。

細胞分裂的第二個關鍵步驟是細菌細胞壁的合成和分離。Miller等報道，細胞壁合成過程受阻時，細菌發生絲狀形變[50]。Jiang 等使用理論模型來描述細胞壁生長與細胞骨架細絲在塑造細菌細胞形狀過程中的相互作用，證明了細菌中細胞骨架蛋白MreB控制細胞形態并確定細胞呈球形還是棒狀，缺失MreB的生長細胞表現出有利于向球形細胞發展的不穩定性，MreB可機械加固細胞壁并防止不穩定的發生。該模型證實有和沒有MreB的形態變換是可逆的，并定量描述了不規則形狀的細胞生長模式和正在經歷分裂的細胞生長模式[51]。

3 細菌絲狀形變的生物學及臨床意義

現有研究提示，細菌絲狀形變是其一種生存策略。細菌在營養缺陷[52]、放射性污染[35,37]、被宿主免疫系統攻擊[53-54]及臨床抗生素處理[50,55]等條件下，均會產生絲狀形變，相關基礎與應用研究是現代微生物學研究的焦點之一[56]。

3.1 營養缺陷

細菌在艱難的環境中“夾縫求生”，對其生存最大的威脅就是單一或多種營養的缺失，在這種情況下細菌經常以絲狀形變來應對。細菌絲狀形變增加了單個細菌的表面積，提高了細菌的吸收和吸附能力[57]。例如，鏈球菌細胞壁合成需維生素B6，維生素B6突變株呈絲狀生長[58]。在消耗型營養缺失的條件下，DNA合成底物缺少，導致染色質受損，細菌誘導出SOS反應，出現絲狀生長[59]。

3.2 紫外線照射

細菌受到紫外線照射時，會產生DNA損傷[36]，DNA損傷誘導SOS反應，阻斷細菌分裂發生，導致細菌絲狀生長[35]。絲狀細菌中發生的DNA修復及修復過程中產生的突變，均能提高細菌在不利環境中生存的可能性，提示絲狀形變的產生可能是細菌應對放射性污染的重要機制。

3.3 逃逸宿主免疫系統

病原體進入機體后，受到人體免疫系統細胞和因子的攻擊。研究表明，細菌可能通過絲狀形變來應對免疫系統的壓力[54]。2004年，Justice等報道了尿道致病性大腸埃希菌(uropathogenicEscherichiacoli，UPEC)感染表面膀胱上皮細胞，胞內感染的UPEC可從桿狀變成長絲狀，并從上皮細胞中逃離出來，成為感染周邊細胞的主力軍[60]。逃離出來的長絲狀細菌可抵抗宿主免疫細胞的吞噬，在大腸埃希菌的致病性中起關鍵作用[61]。UPEC長絲狀形成的機制是受SulA蛋白調控，但誘因尚未明確[54]。其他研究表明，免疫細胞中釋放的一氧化氮(nitric oxide，NO)可能是細菌在宿主細胞中出現長絲狀生長的一個原因。NO可導致細菌基因組斷裂，引起DNA損傷，從而誘導SOS反應[53]，使細菌獲得生存的機會。

細菌以絲狀形變應對宿主免疫攻擊的策略也被用于應對天然捕食者。研究發現，四膜蟲只能捕食短于15 μm的細菌。當四膜蟲以液化沙雷菌(Serratialiquefaciens)為食物時，中間長度的細菌(2～10 μm)被捕食5 h后占比從46%減少為0；>30 μm的細菌占比從4%上升至50%[62]。同樣的長絲狀形變也在彎桿菌屬(Flectobacillusspp.)被赭球蟲(Ochromonassp.)捕食時出現[63]。在自然環境中，細菌被捕食時出現絲狀形變的機制尚不清楚。

3.4 長絲狀形變與耐藥

目前臨床面臨著非常嚴峻的耐藥問題。研究表明，細菌通過絲狀形變可獲得耐藥性或降低對抗生素的敏感度。

環丙沙星和喹諾酮類抗生素通過作用于DNA拓撲異構酶來抑制細菌染色體的復制[64]。在高劑量抗生素作用下，98%的細菌被殺死，留下一小部分長絲狀生長的細菌[65]。低劑量時，基本上所有細菌呈長絲狀生長狀態，并伴隨著耐藥突變體的出現[66]。2015年，Bos等發現在最低抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為 0.125 mg/L 的環丙沙星處理下，細菌發生了絲狀形變，并觀察到絲狀菌頂端發生了不對稱分裂，產生了單細菌。與初始細菌相比，通過過濾分離得到的單細菌的耐藥菌比率增加了250倍[66]。研究發現，喹諾酮類抗生素通過阻斷染色體復制引發SOS反應，導致細菌絲狀形變的發生[67]。Cirz等通過在細菌中表達不能被降解的LexA蛋白，抑制細菌SOS反應，阻斷了耐藥菌的出現[68]。結果提示，細菌的耐藥性可能是通過SOS絲狀細菌中DNA損傷修復機制獲得的。

此外，在某些β-內酰胺類抗生素處理下，細菌會出現一群停止生長或保持低速率生長的亞群，該亞群對抗生素的敏感度下降[69]。2004年，Miller等證明氨芐西林通過DpiBA雙信號系統介導細菌的絲狀生長，并進化出耐藥的非遺傳性突變[50]。氨芐西林通過抑制細胞壁合成干擾細菌分裂而導致長絲狀形態，細菌生長緩慢甚至不生長，可提高細菌存活率。

在以上不適合細菌生長的情況下，細菌可能通過SOS反應觸發細菌中DNA損傷修復機制(這是一種準確性差的修復方式，在修復的同時可抑制細胞分裂，細胞只生長但不復制)，獲得更多的修復時間，以致發生絲狀形變并同時產生高頻度的基因變異。對細菌來說，這個條件既可是致命的，也可是置之死地而后生的，例如細菌耐藥性很有可能由此獲得。自然環境中細菌被捕食時出現絲狀形變的機制尚不清楚，提示需對細菌出現絲狀形變及細菌自我保護機制進一步研究，這對解決細菌耐藥性、尋找新的抗菌藥物或抑制細菌生長的新的作用靶點均具有重要意義。

4 結語

細菌的形態與形態改變具有重要的生物學及臨床意義。早期研究認為，大多數的形態改變是致死條件下的病態或瀕死的表型；隨著研究的深入，發現細菌的形變可能是應對不利環境的一種適應或生存的策略。但我們認為，除了面對死亡或求生之外，還有其他驅動細菌形變的機制存在。

盡管細菌形態改變機制尚未完全清楚，但已有的機制研究提示其對控制感染有重要意義。細菌通過絲狀形變逃逸宿主免疫系統，并在抗生素處理后產生耐藥。對抗生素所致細菌形態改變的深入研究，可幫助臨床合理使用抗生素以控制感染；此外，細菌的不同形態改變也可作為新型抗生素篩選的重要指標。