利用I-Mutant2.0輔助設計與優化中東呼吸綜合征冠狀病毒融合抑制多肽

曲玉辰，陸路，姜世勃

復旦大學基礎醫學院醫學分子病毒學教育部/衛生部重點實驗室，上海 200032

Ⅰ型膜融合蛋白是一類廣泛分布于Ⅰ型包膜病毒表面的膜蛋白，可通過形成螺旋結構來介導病毒包膜與宿主細胞膜的融合過程，從而實現病毒感染。Ⅰ型膜融合蛋白的主要功能區域分為N端融膜肽FP、N端螺旋區HR1與C端螺旋區HR2[1]。在早期病毒感染過程中，病毒膜蛋白與宿主細胞膜表面的受體結合，融合蛋白發生結構改變，FP插入宿主細胞膜，同時HR1與HR2暴露于親水環境中，導致結構不穩定而進一步折疊，形成六螺旋結構(six-helix bundle，6HB)，使病毒包膜與宿主細胞膜彼此靠近，發生膜融合(圖1)[2-7]。基于抑制6HB形成的多肽類病毒融合抑制劑是一類多肽片段，通過模擬病毒HR1-HR2區段的氨基酸序列，在病毒6HB形成過程中與病毒蛋白發生競爭性結合，阻礙6HB正常形成，進而抑制病毒融合過程(圖1)。1993年，姜世勃等首次報道了第1個針對人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)gp41蛋白的病毒融合抑制多肽——SJ-2179[8-9]。1994年，Wild等報道了另一個多肽——DP-178[10]。2003年，美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準恩夫韋肽(T-20)為第1個基于病毒融合抑制原理的抗HIV多肽藥物，用于治療對常用抗HIV藥物產生耐受的艾滋病患者。

圖1Ⅰ型膜融合蛋白介導的膜融合過程可被多肽類病毒融合抑制劑所抑制

Fig.1ClassImembranefusionprotein-mediatedmembranefusioncouldbeterminatedbyvirusfusioninhibitors

基于抑制6HB形成的多肽類融合抑制劑的序列來源于病毒原始序列。在大多數情況下，病毒的原始序列完全能明顯表現出病毒包膜蛋白介導的膜融合抑制活性。但為追求更好的抑制效果，研究者一般會在融合抑制劑序列中引入突變，從而獲得更強的抑制活性。傳統融合抑制劑序列的設計與優化，建立在對病毒融合蛋白尤其是HR1-HR2區段三級結構及四級結構的充分認識之上。雖然可通過helical wheel模型[11-14]并根據二級結構建立氨基酸側鏈之間的相互作用關系進行優化設計，但這種相互作用關系并不準確，優化設計的成功率往往較低，難以在較短時間內確定有活性的優化位點。對于更高效率的序列優化，則需結合蛋白質晶體結構信息，利用tripartite模型[15]確定精確的氨基酸相互作用。

基于抑制6HB形成的多肽類融合抑制劑不僅可用于治療慢性感染，還可用于新發突發傳染病的應急救治。近年來，隨著人類社會的發展，不同地區的人員往來日益增多，造成新發突發傳染病頻繁暴發，如嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)[16]、中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome, MERS)[17]、埃博拉出血熱(Ebola hemorrhagic fever)[18]等，造成嚴重人員死亡與廣泛恐慌。多肽類病毒融合抑制劑的安全性高，活性強，研發流程較簡單，是應對突發傳染性疾病的候選急救藥物之一。然而，人們對導致新發突發傳染病的病毒往往缺少蛋白質結構的詳細信息，利用傳統優化設計手段開發藥物較為盲目，準確性較低，且主觀性較大，嚴重影響了開發工作的效率。因此，有必要開發一種新的不依賴病毒蛋白三級結構信息的設計與優化方法，作為多肽類病毒融合抑制劑優化設計的輔助手段，以克服傳統設計方法的缺點。

隨著計算機技術的發展，機器的運算、學習能力不斷增強，利用計算機工具分析蛋白質信息逐漸成為常用的研究手段，尤其是對蛋白質結構的分析與穩定性預測。利用計算機軟件開發基于抑制6HB形成的多肽類融合抑制劑能彌補傳統設計手段的不足。融合抑制劑與病毒蛋白之間形成的6HB與病毒融合蛋白的天然6HB有相似的三維結構，兩者之間也存在相似的氨基酸相互作用和相似的熱力學性質，因此融合抑制劑的抑制活性與6HB結構之間的穩定性相關。若某位點的突變能使6HB更加穩定，則該位點對應位置的突變可能導致病毒融合抑制劑與病毒融合蛋白的結合能力升高，即抑制活性增強。I-Mutant2.0是一種在線蛋白質穩定性預測軟件，其計算方法建立在對大量蛋白質及其突變后穩定性變化數據庫的機器學習[19]。通過分析蛋白質的一級結構信息，該軟件可預測出某一點引入某特定突變后蛋白質整體穩定性的變化規律。I-Mutant2.0常用于設計高度穩定的蛋白質結構，或驗證序列中某一位置對突變的敏感性等信息。研究者可通過I-Mutant2.0來尋找6HB中的穩定性突變，進而開展針對特定病毒6HB形成的多肽類病毒融合抑制劑的設計工作。

為驗證I-Mutant2.0作為多肽類融合抑制劑輔助設計手段的可行性，本研究以中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)作為研究對象，設計基于抑制6HB形成的多肽類病毒融合抑制劑。MERS最早在2012年于中東地區暴發，是一種由MERS-CoV感染引起的傳染性疾病[17]。MERS-CoV是Ⅰ型包膜病毒，其膜表面S蛋白三聚體介導病毒膜融合過程[20-23]。MERS-CoV S蛋白的HR2及相鄰的不規則螺旋區段表現出較強的病毒抑制活性，是設計病毒融合抑制劑的高效位點。本研究利用I-Mutant2.0作為輔助手段，預測S蛋白的HR2及相鄰區段發生特定突變后對MERS-CoV S蛋白6HB整體穩定性的影響，尋找有利于設計MERS-CoV融合抑制劑的突變，并根據預測結果設計4條驗證性多肽。圓二色譜(circular dichroism spectrum，CD)測量、細胞-細胞融合抑制及假病毒融合抑制等結果顯示，不同多肽的病毒抑制活性受突變影響而變化的規律符合預期，證明I-Mutant2.0可用于輔助設計多肽類病毒膜融合抑制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系293T細胞由本實驗室保存，Huh-7細胞購于中國科學院細胞庫，均用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培養基，于37 ℃、5%CO2條件下培養。

1.1.2質粒pAAV-IRES-EGFP與pAAV-IRES-MERS-EGFP質粒均為本實驗室于先期研究工作中構建并保存。pcDNA3.1-MERS-S及pNL4-3.luc.RE由美國血液中心杜蘭英博士惠贈。

1.1.3檢測試劑盒熒光素酶檢測試劑盒由美國Thermal Scientific公司生產。

1.2 方法

1.2.1利用I-Mutant2.0預測蛋白質的結構穩定性I-Mutant2.0(http://folding.biofold.org/i-mutant/i-mutant2.0.html)是一款免費的蛋白質穩定性分析軟件，可基于蛋白質的PDB ID或序列一級結構信息分析單個突變對蛋白質整體穩定性的影響[19]。向服務器提交希望引入突變的位置與突變種類后，突變后蛋白質穩定性的變化會以吉布斯自由能變化量(ΔΔG)的形式呈現。ΔΔG指某一假定的熱力學變化過程始末，蛋白分子內能變化量受突變影響而產生差異的值，常用于蛋白質的分子動力學分析[24-27]。如突變使蛋白質趨于穩定，則ΔΔG>0，反之則表明突變后蛋白質穩定性下降。MERS-CoV S蛋白HR2區段及相鄰線性區域序列已被證明具有抗MERS-CoV感染的融合抑制劑活性，因此本研究選擇S蛋白6HB氨基酸序列作為研究對象(PDB ID：4njl)，提交每個位點的19種天然氨基酸突變。

1.2.2分析驗證性多肽的二級結構性質MERS-CoV S蛋白HR1、HR2區段衍生多肽在溶液中相互作用，能形成穩定的二級結構，可被圓二色譜檢測探知[28-29]。根據圓二色譜檢測的基本原理，將每種被檢測多肽以磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(pH 7.4)稀釋至終濃度為10 μmol/L，溫度設定為20 ℃。通過J-815圓二色譜檢測儀測得溶液平均殘基橢偏率[θ]，[θ]222為 -33 000 deg·cm2·dmol-1時溶液中的多肽完全呈現螺旋狀態。多肽復合物的熱穩定性通過[θ]222進行測量，將溶液從20 ℃逐步升溫至99 ℃，升溫幅度5 ℃/min。熱變性曲線通過平滑處理后，設定上升斜率最大處為熔解溫度(melting temperature，Tm)。

1.2.3MERS-CoVS蛋白介導細胞-細胞融合抑制實驗細胞-細胞融合抑制實驗常用于測定藥物的抗病毒活性[30-31]。根據細胞-細胞融合抑制實驗的基本原理，本研究以表達MERS-CoV S蛋白與增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)的293T細胞作為效應細胞，以表達DPP4的Huh-7細胞作為靶細胞[23]。將Huh-7細胞預先培養于含10%FBS的DMEM培養基，在96孔板中形成單層細胞，每孔加入1×104個轉染了pAAV-IRES-MERS-EGFP質粒的293T細胞。293T細胞與不同濃度的多肽預混(轉染了pAAV-IRES-EGFP的293T細胞以相同條件與Huh-7細胞混合，作為陰性對照)并繼續培養。由于293T細胞表達綠色熒光蛋白，通過熒光顯微鏡觀察細胞中綠色熒光蛋白的分布即可獲知細胞融合情況。將293T細胞與Huh-7細胞共同培養3 h，取出96孔板并在熒光顯微鏡下拍照。每孔取5個視野(上、中、下、左、右)，計算融合細胞數目及未融合細胞數目的平均數。細胞-細胞融合抑制率根據如下公式計算：[1-(E-N)/(P-N)]×100%。其中，E代表實驗組中融合細胞占所有細胞的比例；P代表陽性對照組中(多肽濃度為0)融合細胞占所有細胞的比例；N代表陰性對照組中融合細胞占所有細胞的比例。多肽的細胞-細胞融合抑制活性可通過半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)比較。

1.2.4MERS-CoV假病毒抑制實驗假病毒包裝與感染系統常用于冠狀病毒的感染與藥物研究[32]。根據假病毒包裝與感染的基本原理，本研究利用MERS-CoV S蛋白真核表達質粒pcDNA3.1-MERS-S與HIV骨架質粒pNL4-3.luc.RE共同轉染293T細胞，獲得表面包裝MERS-CoV S蛋白的假病毒顆粒。假病毒骨架中包含熒光素酶報告基因，感染后可利用熒光素酶檢測試劑盒測定假病毒感染水平。將pcDNA3.1-MERS-S與pNL4-3.luc.RE共同轉染293T細胞，用含10%FBS的DMEM于37 ℃培養48 h，收取上清液。為測定假病毒濃度，將Huh-7細胞培養于96孔板，每孔2×104個。將含假病毒的上清液倍比稀釋后加入96孔板，感染Huh-7細胞12 h后棄去含病毒的培養基，更換新鮮的含2%FBS的DMEM繼續培養72 h，然后棄去上清液，用熒光素酶檢測試劑盒檢測Huh-7細胞中熒光素酶表達水平。選取熒光強度為 10 000～20 000 時的假病毒懸液，進行下一步假病毒感染抑制實驗。將假病毒與不同濃度多肽混合后，加入Huh-7細胞，感染12 h，換液后繼續培養72 h，檢測熒光素酶，過程如前文所述。假病毒感染抑制率根據如下公式計算：[1-(E-N)/(P-N)]×100%。其中，E代表實驗組中熒光強度；P代表陽性對照組(不加入多肽)中熒光強度；N代表陰性對照組(不加入假病毒)中熒光強度。

1.3 統計學方法

所有實驗結果均來自至少3次重復獨立實驗的數據。采用GraphPad Prism 6.0軟件分析數據，行未配對雙尾t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 利用I-Mutant2.0設計MERS-CoV多肽類融合抑制劑

為尋找促使6HB更加穩定的突變位點，本研究采用I-Mutant2.0預測MERS-CoV S蛋白6HB序列發生突變后對蛋白整體穩定性的影響，分析第 1 251～1 288 位氨基酸位點中每個位點可能發生的19種天然氨基酸突變，并將結果匯總(圖2A)。結果顯示，在分析的所有氨基酸位點中，一些位點的平均ΔΔG明顯高于總體水平，意味著這些位置上穩定性突變較多，優化后可能造成6HB更加穩定，對應的融合抑制劑的抑制活性升高；而有些位點的平均ΔΔG明顯低于總體水平，意味著這些位置上不穩定性突變較多，優化后可能造成6HB不穩定，對應的融合抑制劑的抑制活性下降。根據預測，前者由于適合進行優化，稱為“有利位點”；后者不適合優化，稱為“不利位點”。在所有位點的計算結果中，選取5個有利位點：E1265、S1268、Q1270、Q1271、K1274。它們的平均ΔΔG高于整體水平，大多數突變ΔΔG>0，呈現為穩定性突變，且部分突變ΔΔG>1，表現出較強的穩定性。同時，選擇4個不利位點：L1269、V1272、V1273、L1276。它們絕大多數突變ΔΔG<0，平均ΔΔG低于整體水平，表現出明顯的不穩定性。針對上述位點，設計4條多肽類融合抑制劑：MEO代表MERS-CoV S蛋白HR2原始序列，F4UH與F5UH分別代表有利位點引入優化突變后的融合抑制劑，而F4UD代表不利位點引入突變后的融合抑制劑(圖2B)。所有位點優化均遵循極性相似且對應ΔΔG較高的原則，如果該位點上所有突變對應ΔΔG均<0，則選擇對應ΔΔG最高的突變進行優化。

A: By introducing mutations into 1246-1288 positions in HR2 sequence, a series of ΔΔG results listed above could be obtained. Positive ΔΔG is marked in blue and negative ΔΔG is marked in red. Wild type sequence is marked in blank blocks. B:Four fusion inhibitors were designed according to ΔΔG results (shown in box-plot). Compatible positions with higher average ΔΔG are marked in green, and incompatible positions with lower average ΔΔG are marked in aurantia.

圖2利用I-Mutant2.0設計針對HR1區段的多肽類融合抑制劑

Fig.2I-Mutant2.0usedtodesignfusioninhibitorsagainstMERS-CoVSproteinHR1region

2.2 突變影響融合抑制劑與HR1序列結合

為進一步研究HR1序列與MEO、F4UH、F5UH、F4UD之間的相互作用受突變的影響，本研究采用圓二色譜測量HR1序列多肽HR1P與4條多肽之間相互作用形成的螺旋結構[23]。如圖3A所示，HR1P單獨存在于溶液中時，本身不呈現明顯的二級結構，曲線中未觀察到208 nm與222 nm處明顯的負峰值。MEO、F4UH、F5UH與F4UD單獨存在于溶液中時，只能形成較少的螺旋結構，208 nm與222 nm處負峰不明顯。抑制劑多肽單獨存在于溶液中時，222 nm處峰值均未達到 -20 000，螺旋度<60%。兩者等濃度混合后，HR1P與融合抑制劑相互作用形成6HB，溶液的[θ]明顯升高。結果表明，有79%的MEO與HR1P相互作用形成螺旋結構；F4UH、F5UH分別有86%、87%與HR1P結合形成螺旋結構；而F4UD與HR1P結合能力較弱，僅有51%的多肽形成螺旋結構(表1)。

A: Secondary structure of inhibitors, HR1P and inhibitor/HR1P complex in PBS buffer. CD spectra for inhibitor (10 μmol/L), HR1P (10 μmol/L) and their complex in PBS buffer (pH 7.4) at 20 ℃. The saddle-shaped curve could be observed with double negative peaks at 222 nm and 208 nm. B: CD signal at 222 nm for the inhibitor/HR1P complex as a function of temperature from 20 ℃ to 99 ℃. The thermal melting process could be observed by a rapid leaping of the [θ]222curve from baseline to around -10.

圖3突變影響融合抑制劑與HR1序列結合

Fig.3IntroducedmutationscouldinfluencetheinteractionbetweenfusioninhibitorsandHR1sequence

表1突變影響融合抑制劑與HR1序列結合

Tab.1IntroducedmutationscouldinfluencetheinteractionbetweenfusioninhibitorsandHR1sequence

Peptide mixtureCoiling percentage at 20 ℃TmMEO with HR1P79%87 ℃F4UH with HR1P86%87 ℃F5UH with HR1P87%>99 ℃F4UD with HR1P51%35 ℃

The percentage of coiling structure of the inhibitor/HR1P complex presented at 20 ℃ was calculated by the ratio of [θ]222value to -33 000. Tm value was determined through the climax of the first derivate (d[θ]/dT) against temperature (function not shown).

在此基礎上，測量含各種突變的融合抑制劑與HR1P形成復合物的熱穩定性。通過測量222 nm處溶液[θ]隨溫度的變化，繪制復合物熱變性曲線(圖3B)。結果顯示，MEO、F4UH、F5UH與HR1P相互作用形成的復合物較為穩定。其中，MEO、F4UH與HR1P形成的復合物Tm均位于87 ℃左右，F5UH與HR1P形成的復合物Tm高于99 ℃，而F4UD與HR1P形成的復合物穩定性很低，Tm為35 ℃(表1)。

2.3 突變影響融合抑制劑的細胞-細胞融合抑制活性與假病毒抑制活性

細胞-細胞融合模型是常用的模擬病毒感染早期過程與評估融合抑制劑抑制病毒包膜蛋白介導的膜融合能力的實驗體系[30-31]。本研究利用293T細胞與Huh-7細胞分別表達S蛋白與DPP4蛋白，模擬病毒與宿主細胞早期接觸-融合過程。當293T效應細胞與Huh-7靶細胞共同培養3 h后，MEO、F4UH及F5UH均表現出明顯的抑制細胞融合的能力，而F4UD則不能有效抑制細胞融合(圖4A)。4條多肽抑制細胞-細胞融合的IC50存在顯著性差異：F4UH、F5UH抑制細胞融合的IC50分別為(0.78±0.18)μmol/L、(0.66±0.13)μmol/L，顯著低于MEO的(2.79±0.88)μmol/L；而F4UD的IC50為(24.21±8.39)μmol/L，顯著高于MEO(圖4B，表2)。

A:Inhibitory activity of four inhibitors on MERS-CoV S protein-mediated cell-cell fusion as a function of peptide concentration. B: 50% inhibitory concentration was calculated based on median-effect principle.

圖4突變影響融合抑制劑的細胞-細胞融合抑制活性

Fig.4IntroducedmutationscouldinfluencetheinhibitionofSprotein-mediatedcell-cellfusion

表2突變影響融合抑制劑的細胞-細胞融合抑制活性與假病毒抑制活性

Tab.2IntroducedmutationscouldinfluencetheinhibitionofSprotein-mediatedcell-cellfusionandpseudovirusinfection

PeptideCell-cell fusion IC50(μmol/L)Pseudovirus infection IC50(μmol/L)MEO2.79±0.883.31±0.47F4UH0.78±0.181.71±0.18F5UH0.66±0.130.73±0.09F4UD24.21±8.3937.35±10.04

The IC50of cell-cell fusion and pseudovirus infection was calculated based on median-effect principle, according to cell-cell fusion assay and pseudovirus infection assay.

為進一步驗證引入突變對融合抑制劑抗病毒活性的影響，本研究采用假病毒感染系統來檢測各種突變融合抑制劑的抑制活性。假病毒抑制實驗結果與細胞-細胞融合抑制實驗相似：F4UH、F5UH與MEO均呈現出較明顯的假病毒抑制活性，而F4UD的抑制活性較弱(圖5A)。F4UH、F5UH抑制假病毒的IC50分別為(1.71±0.18)μmol/L、(0.73±0.09)μmol/L，MEO的IC50為(3.31±0.47)μmol/L，F4UH、F5UH的IC50顯著低于MEO；F4UD的IC50為(37.35±10.04)μmol/L，顯著高于其他三者(圖5B，表2)。

A:Inhibitory activity of four inhibitors on MERS-CoV pseudovirus infection in Huh-7 cells. B: 50% inhibitory concentration was calculated based on median-effect principle.

圖5突變影響融合抑制劑的假病毒抑制活性

Fig.5Introducedmutationscouldinfluencetheinhibitionofpseudovirusinfection

3 討論

為解決基于抑制6HB形成的多肽類融合抑制劑設計過程中病毒蛋白晶體結構信息缺失對優化設計工作的限制，本研究使用I-Mutant2.0軟件作為輔助手段，預測在MERS-CoV S蛋白HR2區段存在若干優化位點，并根據預測結果設計4條多肽。結果表明，與病毒融合抑制劑原始序列MEO相比，在有利位點引入突變，使F4UH、F5UH與HR1P結合的能力提升，其細胞-細胞融合抑制活性與假病毒抑制活性也得到不同程度的提升；而在不利位點引入突變，導致F4UD與HR1P結合能力下降，細胞融合抑制活性、假病毒抑制活性也均下降。這不僅印證了I-Mutant2.0對MERS-CoV S蛋白HR2序列分析和預測的結果，還證明利用I-Mutant2.0可在不依賴病毒蛋白三級結構的情況下更高效、更準確地確定多肽類病毒融合抑制劑中適合優化的位置。

計算機輔助分析手段曾用于設計小分子融合抑制劑和多肽類融合抑制劑[33-37]，但傳統手段往往依賴對蛋白質分子三級結構詳細信息的了解。本研究提供了一種新的思路：對于相關蛋白信息較為缺乏的新發突發傳染病，可使用計算機軟件作為替代手段，為融合抑制劑的優化設計提供方向，提高研究的目的性與效率。本研究采用的方法是基于蛋白質結構穩定性的原理進行整體分析，并不局限于特定氨基酸之間的相互作用，同樣可用于Ⅰ型包膜病毒以外的病毒融合抑制劑研究，在新藥開發領域有較好的應用前景。

值得注意的是，I-Mutant2.0基于熱力學穩定性做出的預測僅能用于提升融合抑制劑的抑制活性，而融合抑制劑的優化設計往往要追求多種屬性的提升，如溶解性、耐儲存性、逃逸耐受能力與抗原性等，一味追求抑制活性的提升可能造成融合抑制劑的其他屬性受到影響。因此，在實際操作過程中，應謹慎選擇所要使用的方法。