抗結核藥物及其耐藥相關突變位點的研究進展

陳昕昶，陳嘉臻，張文宏

復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040

結核病是由結核分枝桿菌復合物引起的傳染性疾病，其致死率、致殘率高，在全球傳染病中居第2位，僅次于艾滋病。2015年，全球估計新發結核病約 1 040 萬例，其中新發耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)48萬例，但不足20%的患者登記接受診療[1]，這不僅會導致治療失敗，還可能引起耐藥菌株傳播。因此，耐藥結核病的診斷仍面臨巨大挑戰，目前不僅需完成結核病的早期診斷，更需快速、全面的耐藥診斷。

傳統的結核病診斷方法包括鏡檢、培養等，而耐藥診斷必須基于培養，受限于技術、人員、基礎設施，且周期長，極易延誤治療時機。此外，很多藥物的表型藥敏試驗(drug susceptibility testing，DST)重復性差，部分二線藥物缺乏標準化的DST[2]。

目前，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)認可的MDR-TB商業分子檢測試劑盒有Xpert MTB/RIF(Cepheid，USA)、GenoType MTBDRplus和GenoType MTBDRsI (Hain Lifescience GmbH，Germany)，分別可檢測利福平(rifampicin，RFP)、異煙肼(isoniazid，INH)、氟喹諾酮類(fluoroquinolones)及二線注射類抗結核藥物的耐藥。這些方法簡單易行，不依賴培養，且靈敏度、特異度較高，已得到較廣泛的應用[3-4]。但現有分子檢測方法僅能檢測小部分抗結核藥物的耐藥情況，且尚無其他二線藥物的耐藥信息，導致DST結果出來前無法給予最佳治療，或出現不良反應后無法根據藥敏結果調整方案，從而無法滿足臨床需求。

確定抗結核藥物耐藥基因及突變位點是耐藥診斷、臨床用藥指導、新藥研發及耐藥機制進一步研究的基礎，本文對多種抗結核藥物及其耐藥相關基因、突變位點的研究進展進行了總結，詳見表1。

表1抗結核藥物常見耐藥相關基因及其功能

Tab.1Resistance-relatedgenesandtheirfunctionsinanti-tuberculosisdrugs

藥物名稱英文名稱耐藥相關基因基因功能異煙肼IsoniazidkatG過氧化氫-過氧化物酶inhA烯酰ACP還原酶利福平RifampicinrpoBRNA聚合酶β亞基乙胺丁醇EthambutolembB阿拉伯糖基轉移酶吡嗪酰胺PyrazinamidepncA吡嗪酰胺酶rpsA核糖體蛋白S1panD天冬氨酸脫羧酶鏈霉素StreptomycinrpsL核糖體蛋白S12rrs16S rRNAgidB7-甲基鳥苷甲基轉移酶氟喹諾酮類FluoroquinolonesgyrADNA旋轉酶A亞基gyrBDNA旋轉酶B亞基二線注射類藥物Kanamycin/Amikacin/Capreomycinrrs16S rRNAeis氨基糖苷類乙酰轉移酶tlyArRNA甲基轉移酶whiB7轉錄調控因子乙硫異煙胺/丙硫異煙胺Ethionamide/ProthionamideethA黃素單加氧酶inhA烯酰ACP還原酶環絲氨酸D-CycloserinealrD-丙氨酸消旋酶aldL-丙氨酸脫氫酶ddlD-丙氨酸連接酶cycAD-絲氨酸質子轉運體氯法齊明Clofaziminerv0678外排泵MmpL5的轉錄抑制因子pepQ未知利奈唑胺Linezolidrrl23S rRNArplC核糖體蛋白L3

1 一線藥物

1.1 INH

INH是一種前體藥，由過氧化氫-過氧化物酶(KatG)激活，產生的陰離子或游離自由基與NAD+結合，形成NADH化合物，并與NADH依賴的烯酰ACP還原酶(InhA)結合，抑制InhA的活性，破壞細胞壁分枝菌酸的合成，從而達到殺菌目的。

目前公認的與INH耐藥相關的突變主要發生于katG和inhA啟動子區域，最常見的是katG315。一項系統性綜述研究了5 505株INH耐藥臨床菌株，發現katGSer315Thr(AGC→ACC)和Ser315Asn(AGC→AAC)突變分別占全部INH耐藥菌株的 93.4% 和 3.6%[5]。其次常見的是inhA啟動子區域C15N、T8N、G17T突變，據報道C15N突變占INH耐藥臨床菌株的10%～34%[6-7]。

有多篇文獻報道過fabG1、kasA、iniA、iniB、iniC、ndh、aphC及其啟動子區域等與INH耐藥相關的基因，但這些突變與katG、inhA中的突變同時發生，或在INH敏感菌株中不罕見，因此不能將其作為耐藥診斷的標記[8]。

1.2 RFP

RFP通過與RNA聚合酶β亞基結合，抑制mRNA合成。結核分枝桿菌RNA聚合酶β亞基由rpoB編碼，其發生突變會導致β亞基的構象發生改變，導致RFP無法與之結合。

絕大多數rpoB耐藥相關突變發生于RFP耐藥決定區(rifampicin resistance-determining region，RRDR)，即密碼子507～533這一81 bp區域，占全部rpoB耐藥相關突變的95%～97%，其中最常見的是密碼子516、526、531[9-10]。也有文獻報道了RRDR以外的耐藥相關突變，且耐藥的產生不僅與突變位點有關，不同堿基突變類型導致的耐藥水平也不同。

前期研究顯示，利福布汀、利福噴汀和RFP三者之間交叉耐藥性很高。據報道，12%～36%RFP耐藥臨床菌株對利福噴汀敏感，隨后有研究證實，只有對RFP高度耐藥的菌株才對利福噴汀耐藥[11]。rpoC、rpoA基因作為補償突變不直接導致耐藥，但可用作預測耐藥的標記[12]。

1.3 乙胺丁醇(ethambutol，EMB)

EMB能抑制阿拉伯糖基轉移酶對阿拉伯半乳聚糖的聚合作用，從而影響分枝桿菌細胞壁形成。阿拉伯糖基轉移酶由embB基因編碼，embB及其操縱子embCAB中的突變與EMB耐藥有關。

突變最常發生于EMB耐藥決定區(EMB resistance-determining region，ERDR)，其中密碼子306、406、497最常見[13]，具有靈敏度低但特異度較高的特點。據報道，embB306突變占EMB耐藥臨床菌株的50%～70%，embBMet306Val和Met306Leu與EMB高度耐藥相關。用embB306作為耐藥檢測標記的靈敏度為 57.8%，特異度為 78.8%[14]。

在約30%的EMB耐藥菌株中找不到上述3個最常見的突變位點。據報道，embC與embA突變共占EMB耐藥菌株的10%～15%[14-15]。過表達ubiA基因的野生型菌株對EMB耐藥，且已在臨床菌株中得到驗證[16-17]。ubiA產物聚十異戊二磷酰-β-D-5-磷酸核糖(decaprenyl phosphoryl-β-D-5-phosphoribose，DPPR)合成酶的作用是催化聚十異戊二磷酰-β-D-阿拉伯糖(decaprenyl phosphoryl-β-D-arabinose，DPA)生成，ubiA發生突變時DPA水平升高，而DPA能競爭性抑制 EMB與其靶點 EmbB 結合，從而導致耐藥[18]。

1.4 吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)

PZA的最大特點是可在酸性環境中作用于巨噬細胞及炎性組織內的休眠期或半休眠期結核分枝桿菌。PZA需經過吡嗪酰胺酶(pyrazinamidase, PZAase)處理為吡嗪酸(pyrazinoic acid，POA)后才能發揮殺菌作用。目前普遍認為，PZAase的編碼基因pncA及其周圍區域的突變是導致PZA耐藥的主要原因。

pncA的突變具有多樣性[19-20]，全長561 bp的突變多態性達54%，表現為不同程度的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)升高，基本無規律可循，且突變類型多變。據報道，pncA突變具有地域性，在中國、南非、日本等國某些地區其基因型耐藥與表型耐藥的一致性較高，可達90%以上；在某些地區達40%～80%[21-23]。

rpsA的產物為核糖體蛋白S1。目前認為，rpsA的C端突變會導致蛋白結構改變，使其無法與POA結合，導致PZA耐藥。panD突變導致耐藥的機制可能是panD編碼的天冬氨酸脫羧酶是PZA或POA的作用靶點[24]。以上兩個基因突變的發生率較低，且多與低度耐藥相關，研究尚不完全[25]。

2 二線藥物

2.1 氟喹諾酮類

常見氟喹諾酮類藥物包括左氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星。其作用位點是DNA旋轉酶，該酶由兩個亞基組成，分別由gyrA和gyrB編碼。

喹諾酮耐藥決定區(quinolone resistance-determining region，QRDR)主要由gyrA及gyrB的保守區組成[26]，即gyrA密碼子74～113及gyrB密碼子500～540。2012年有系統性綜述共納入 1 220 株耐喹諾酮類臨床菌株，發現gyrA中QRDR的突變率為780/1 220(64%)，gyrB中QRDR的突變率為17/534(3%)。gyrA最常見的突變在密碼子90、91、94，占54%(654/1 220)[27]。也有研究報道了QRDR以外的突變位點。

有研究發現，gyrA和gyrB的突變位點與耐藥程度有關，通常認為gyrA88、90、91、94等密碼子的突變與高度耐藥相關，而gyrB的突變與低度耐藥相關；且不同位點的突變、同一位點不同突變類型對各藥物的耐藥程度不同。約30%耐喹諾酮類臨床菌株未找到QRDR中的耐藥突變，提示還有其他未發現的耐藥相關突變。

2.2 卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素(kanamycin/amikacin/capreomycin，KAN/AMK/CAP)

氨基糖苷類藥物(AMK、KAN)通過與16S rRNA及核糖體30S小亞基結合，干擾蛋白質合成。CAP是一種環多肽類藥物，抗菌機制與氨基糖苷類藥物類似，主要是抑制肽基-tRNA的轉移和蛋白質合成。

rrs基因中有3個常見耐藥相關位點，即1401、1402和1484，其中rrsA1401G最常見(占30%～90%)。A1401N和G1484N導致3種藥物交叉耐藥，對KAN和AMK高度耐藥，對CAP的MIC影響不定[28]。rrsC1402N主要引起CAP耐藥，對KAN耐藥的陽性預測值為50%，與AMK耐藥基本無關[29]。總體來說，rrs對預測AMK耐藥的一致性較強，但對KAN和CAP靈敏度不夠。

tlyA(rRNA甲基轉移酶)、eis(氨基糖苷類乙酰轉移酶)及whiB7(轉錄調控因子)也與上述藥物耐藥有關。其中tlyA與CAP低度耐藥相關[30]。eis啟動子區域10、14、37位點突變與KAN耐藥相關，還可導致CAP低度耐藥[31]。whiB7中非翻譯區(untranslated region，UTR)突變及eis基因啟動子區域突變占結核分枝桿菌KAN耐藥菌株的 26%～80%[32]。這些基因導致耐藥的機制尚不明確。

2.3 鏈霉素(streptomycin，SM)

SM通過附著于細菌核糖體30S亞基的16S rRNA(rrs)和核糖體蛋白S12(rpsL)，干擾甲氨酰tRNA與核糖體小亞基的結合，抑制翻譯啟動，還可干擾校正過程，影響蛋白質的合成而發揮抗菌作用。因此，編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因和編碼16S rRNA的rrs基因突變是產生對SM耐藥的主要機制。

大多數SM耐藥突變發生于rpsL基因的密碼子43和88，以及rrs基因的530和912環，其中rpsL基因突變占SM耐藥菌株的 13.2%～80%，rrs突變占0%～28%[33-34]，所占比例因地理位置、結核分枝桿菌分型不同而異。

gidB基因全長675 bp，全長均可發生突變。已在至少173個位點發現過突變，多態性達26%。目前認為gidBL16R、E92D為多態性，與耐藥無關，是種系發展的標記，其中gidBL16R與LAM型相關，E92D與北京型相關[35]。

2.4 乙硫異煙胺(ethionamide，Eto)和丙硫異煙胺(prothionamide，Pto)

Eto和Pto是碳硫胺類藥物，為異煙酸衍生物。其作用機制與INH相似，通過抑制結核分枝桿菌分枝菌酸合成而殺菌。Eto需被ethA編碼的包含FAD的NADPH特異性單氧化酶激活，隨后通過抑制InhA的活性破壞細胞壁分枝菌酸的合成，從而達到殺菌目的。因此，ethA突變占Eto耐藥菌株的47%，inhA及其啟動子區域突變占55%[36]。ethA基因中的耐藥突變具有多樣性，散布于基因全長，尚未發現分布規律。這兩種藥物與INH有部分交叉耐藥。據報道，inhA及其啟動子區域同時發生突變會導致INH高度耐藥及INH與Eto交叉耐藥，交叉耐藥率達 95.12%[37-38]。

2.5 環絲氨酸(D-cycloserine，DCS)

DCS是D-丙氨酸的環狀類似物。其作用機制是通過阻斷D-丙氨酸消旋酶(alanine racemase,Alr)，使L-丙氨酸無法變構為D-丙氨酸，無法在D-丙氨酸連接酶(D-alanine∶D-alanine ligase, Ddl)的作用下形成肽聚糖合成的重要原料D-丙氨酸五肽，從而抑制結核分枝桿菌細胞壁肽聚糖的合成。

目前已發現4個與DCS耐藥相關的基因alr、ddl、ald和cycA[39]。ald突變產生的耐藥程度較alr高[40]。cycA編碼的轉運蛋白轉運D-丙氨酸、D-絲氨酸和甘氨酸等[40-41]。ald(Rv2780)編碼L-丙氨酸脫氫酶，已在耐DCS臨床菌株中發現了其突變。

然而，DCS的耐藥率低，對無DCS耐藥表型的MDR菌株并不常規檢測其alr和ddl等基因突變情況。因此，DCS耐藥的臨床情況及分子機制有待進一步探索。

2.6 氯法齊明(clofazimine，Cfz)

Cfz最初是一種用于治療麻風病的藥物，2016年WHO年度結核報道中首次將其列入核心藥物，但作用機制尚不明確。

目前發現的Cfz耐藥基因有rv0678、rv1979c和rv2535c。其中rv0678是一種轉錄抑制因子，其突變會導致外排泵MmpL5表達升高，使多種藥物交叉耐藥[42-43]。rv0678耐藥相關突變具有多樣性，散布于基因全長，未找到分布規律。有體外實驗發現pepQ缺失會導致結核分枝桿菌對Cfz的靈敏度下降，還會導致Cfz與貝達喹啉(bedaquiline)交叉耐藥。

其他耐藥相關基因仍在陸續發現中，需進一步進行臨床驗證和機制研究。

2.7 利奈唑胺(linezolid，LNZ)

目前發現的LNZ耐藥基因主要有23S rRNA的rrl和rplC基因。rrl的主要耐藥突變是G2576T和G2061T[44]，rplC最常見的耐藥突變是Cys154Arg[45]。其中，rplC與較高的MIC相關。這兩個基因突變只涵蓋不到30%的耐藥菌株[46]。

結核分枝桿菌的耐藥機制非常復雜，過去常將表型耐藥與基因型耐藥的不一致歸因于機制研究的不足。但事實上，導致這一現象的原因有很多，如臨界濃度、原發或獲得性耐藥、檢出限度、隨機誤差、基因型與表型之間的錯誤關聯等。此外，現有研究僅專注于耐藥菌株，甚至僅關注MDR及廣泛耐藥(extensively drug resistance，XDR)菌株，而忽視了敏感菌株這一大背景，這種偏移導致耐藥位點的預測價值有限。

耐藥結核病是全球結核病防控工作的主要威脅之一，急需開發和應用新工具進行快速、準確、全面的耐藥診斷。隨著測序技術的成熟、測序成本的降低及生物信息學的發展，對結核病耐藥機制的研究不斷深入，臨床應用全基因組測序檢測結核分枝桿菌耐藥性成為可能。這與近年來一直提倡的精準醫療思路一脈相承，都強調了針對菌株耐藥情況進行抗結核方案調整，使患者最大程度受益。同時，還應在臨床菌株中證實現有耐藥相關突變位點的診斷作用，以解決當前結核病耐藥性問題為導向而開發抗結核新藥。