靶向3D基因shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及功能鑒定

閆碧瑩，徐維禎，鐘照華

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，黑龍江 哈爾濱 150081

B組柯薩奇病毒(coxsackievirus B，CVB)屬小RNA病毒科腸道病毒屬，是人類病毒性心肌炎的主要病原[1]。根據(jù)美國疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，CVB每年可導(dǎo)致大約500萬人患腸道系統(tǒng)疾病，其中20%患有CVB3感染引起的急性心肌炎[2]，在我國也有相應(yīng)疾病的流行報(bào)道[3]。但目前尚無特異性有效抑制CVB感染的藥物[4]。

CVB為無包膜單正鏈RNA病毒，全長 7.4 kb。基因組只有1個開放讀碼框架和2個非編碼區(qū)。開放讀碼框架可編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白(VP1～VP4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白(2A～2C和3A～3D)[5]。其中3D基因編碼RNA依賴的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，合成子代病毒基因組，在CVB感染和復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。黃病毒屬的寨卡病毒[7]、丙型肝炎病毒[8]均為單正鏈RNA病毒。研究表明[7-8]，以病毒RNA聚合酶為靶點(diǎn)的抑制劑抗病毒效果顯著。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進(jìn)化過程中高度保守的雙鏈RNA(double stranded RNA，dsRNA)誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象[9]，能特異性剔除或關(guān)閉靶基因的表達(dá)[10]，已廣泛用于探索基因功能和基因治療領(lǐng)域[11]。慢病毒載體能穩(wěn)定介導(dǎo)基因沉默，不僅轉(zhuǎn)染效率高，還可持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)[12-13]。本研究旨在篩選作用于CVB 3D基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)，并構(gòu)建慢病毒Lenti-sh3D，為后續(xù)抗CVB致病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

表1siRNA靶向序列

Tab.1siRNAtargetingsequences

siRNATarget sequenceSitesiRNA-1043GCAAGGACTATGGATTAATCA1 043-1 063siRNA-1218GGAACCAAAGAATACCCAAGA1 218-1 238siRNA-1281GCACGAATATGAGGAGTTTAT1 281-1 301siRNA-NCTCAGGAGGTCTCGCTAAGTCA—

1 材料與方法

1.1 材料

HeLa細(xì)胞、293T細(xì)胞、CVB3 Woodruff株由本教研室保存，抗CVB3 3D抗體由本教研室制備。pLVTHM、pMD2.G、psPAX2載體(Addgene #12247、#12259、#12260)和StbI3感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，單鏈shRNA由蘇州金維智生物科技有限公司合成。Annealing buffer for DNA oligos(5×)購自Beyotime公司，限制性內(nèi)切酶ClaⅠ、限制性內(nèi)切酶MluⅠ購自紐英倫生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自康寧生命科學(xué)有限公司，T4連接酶、DL15000 DNA Marker、6×Loading Buffer購自大連TaKaRa公司，聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝膠快速制備試劑盒購自EpiZyme公司，PageRuler預(yù)染蛋白Marker購自Thermo Fisher公司，6×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自萬類生物科技有限公司，GAPDH兔多克隆抗體購自美國Proteintech公司，超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司。1周齡BALB/c小鼠購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HeLa、293T細(xì)胞均于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。

1.2.2CVB33DsiRNA靶向序列的設(shè)計(jì)根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中CVB3 3D基因(2157045)的核酸序列，利用BLOCK-iTTMRNAi Designer公用設(shè)計(jì)軟件(http://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/insert.do)設(shè)計(jì)并合成3對siRNA靶向序列及1對陰性對照序列(表1)。

1.2.3CVB33DshRNA的篩選及合成分別將合成的3條siRNA經(jīng)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至已培養(yǎng)24 h的HeLa細(xì)胞(24孔板：5×104個)，同時(shí)設(shè)置陰性對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞沉淀并提取RNA和蛋白，通過定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR)和蛋白免疫印跡法篩選抑制效率最佳的siRNA序列用于設(shè)計(jì)并合成shRNA。合成的shRNA中，loop莖環(huán)結(jié)構(gòu)為TTCAAGAGA，3′ 端加入TTTTT終止信號，5′ 端及3′ 端分別引入ClaⅠ和MluⅠ酶切位點(diǎn)(表2)。

表2構(gòu)建慢病毒載體的shRNA序列

Tab.2TheshRNAsequencesusedforconstructinglentiviralvectors

shRNAPrimershRNA-1043CGCGTCCCCGCAAGGACTATGGATTAATCATTCAAGAGATGATTAATCCATAGTCCTT-GCTTTTTGGAAATshRNA-1218CGCGTCCCCGGATCCAAAGAATACCCAAGATTCAAGAGATCTTGGGTATTCTTTGGAT-CCTTTTTGGAAATScrambled shRNACGCGTCCCCTCAGGAGGTCTCGCTAAGTCATTCAAGAGATGACTTAGCGAGACCTCCT-GATTTTTGGAAAT

1.2.4pLVTHM-3DshRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定將合成的單鏈shRNA配對退火，并將退火產(chǎn)物進(jìn)行200倍稀釋后備用。pLVTHM載體質(zhì)粒經(jīng)ClaⅠ/MluⅠ雙酶切并凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物。將退火產(chǎn)物與獲得的線性化pLVTHM經(jīng)T4連接酶于16 ℃ 連接過夜(不超過12 h)，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌StbI3感受態(tài)，然后涂布于氨芐西林(ampicillin，Amp)抗性LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃過夜培養(yǎng)；隨機(jī)挑取單克隆菌落，接種于Amp抗性LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)；提取質(zhì)粒，酶切，行DNA測序鑒定(測序引物序列：TCGATATGTGTTCT-GGGAAA)。

將酶切及序列比對正確的pLVTHM-3DshRNA 重組質(zhì)粒經(jīng)Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染于已培養(yǎng)24 h的HeLa細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)：5×104)，轉(zhuǎn)染48 h后觀察熒光。收集細(xì)胞沉淀并提取RNA和蛋白，通過RT-qPCR和蛋白免疫印跡法篩選抑制效率最佳的pLVTHM-3DshRNA進(jìn)行慢病毒包裝。

1.2.5慢病毒Lenti-sh3D表達(dá)載體的包裝及干擾效果鑒定將1×106個293T細(xì)胞接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞生長融合度達(dá)70%～80%時(shí)，將pLVTHM-3DshRNA質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2和pMD2.G)利用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。慢病毒包裝所需的3個質(zhì)粒pLVTHM-3DshRNA、psPAX2 和pMD2.G的比例為 4∶2∶1。轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，并觀察熒光。轉(zhuǎn)染后48 h收取病毒上清液，用 0.45 μm微孔濾器過濾，收集過濾液，即得病毒原液Lenti-sh3D。

將慢病毒Lenti-sh3D感染已培養(yǎng)24 h的HeLa細(xì)胞(24孔板：5×104個)，48 h后用CVB3感染(TCID50=10-4.75/mL)24 h，同時(shí)設(shè)對照組。收集細(xì)胞沉淀并提取蛋白，用蛋白免疫印跡法檢測抑制效果。

慢病毒Lenti-sh3D經(jīng)腹腔注射感染1周齡BALB/c小鼠，再用CVB3感染，同時(shí)設(shè)對照組。5 d后取小鼠心臟組織，用蛋白免疫印跡法檢測抑制效果。

1.2.6慢病毒Lenti-sh3D滴度測定將1×104個293T細(xì)胞接種于96孔板，感染時(shí)細(xì)胞融合度為70%。將病毒原液用opti-MEM進(jìn)行梯度稀釋(1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000)，吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100 μL各梯度稀釋液，培養(yǎng)過夜，24 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)3 d。熒光顯微鏡下觀察，根據(jù)公式計(jì)算病毒滴度(滴度=熒光細(xì)胞個數(shù)×相應(yīng)的稀釋倍數(shù))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CVB 3D基因 siRNA有效靶點(diǎn)的篩選

根據(jù)NCBI中3D序列和在線公共設(shè)計(jì)軟件，篩選出3條評分較高的靶向序列，合成siRNA后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，采用蛋白免疫印跡和RT-qPCR檢測3D聚合酶的表達(dá)和病毒復(fù)制情況。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，siRNA-1043的干擾效果顯著(P<0.001)，3D聚合酶表達(dá)的抑制率約為50%(圖1A、1B)。RT-qPCR結(jié)果表明，與對照組相比，3條靶向序列均可有效降低CVB3 RNA，其中siRNA-1043抑制效果較好(P<0.001)，抑制率為 43.7%(圖1C)。綜合以上結(jié)果， siRNA-1043抑制效果顯著，篩選為shRNA候選序列，合成后用于制備慢病毒。

2.2 pLVTHM-3DshRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將干擾效率較高的siRNA-1043和siRNA-1218的寡核苷酸序列合成shRNA，退火后與經(jīng)ClaⅠ和MluⅠ雙酶切的慢病毒骨架質(zhì)粒pLVTHM連接，構(gòu)建pLVTHM-3DshRNA重組質(zhì)粒。ClaⅠ單酶切鑒定結(jié)果顯示，酶切產(chǎn)物大小為 11 085 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。DNA測序結(jié)果顯示，基因序列正確，無突變與缺失(圖2)。由此可見，pLVTHM-3DshRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A: Expression of 3D in CVB3-induced cells after siRNA interference by Western blotting. B: Quantitative analysis of protein expression.n=3,***P<0.001. C: Expression of CVB3 RNA in CVB3-induced cells after siRNA interference by RT-qPCR.

圖1CVB3D基因siRNA有效靶點(diǎn)的篩選

Fig.1ScreeningofeffectivetargetsofCVB3DsiRNA

Sequence of recombinant plasmid.

圖2pLVTHM-3DshRNA重組質(zhì)粒的鑒定

Fig.2IdentificationofpLVTHM-3DshRNAexpressionvector

將所得正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，48 h后觀察熒光表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h后，鏡下可見綠色熒光，表達(dá)量約為60%。

2.3 慢病毒Lenti-sh3D包裝及滴度測試

將pLVTHM-3DshRNA 重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，鏡下可觀察到綠色熒光，收集細(xì)胞上清液并過濾，即為含有慢病毒顆粒Lenti-sh3D的病毒液。取1×104個293T細(xì)胞接種于96孔板，感染時(shí)細(xì)胞融合度為70%～80%，梯度稀釋病毒原液，以感染單位TU/mL表示病毒滴度。3 d后觀測熒光，在10-4稀釋度下可觀測到5個細(xì)胞(圖3)，經(jīng)計(jì)算，制備的慢病毒原液滴度為5×107TU。

Green fluorescence expression at each dilution.

圖3慢病毒Lenti-sh3D滴度的測定

Fig.3DeterminationofLenti-sh3Dtiter

2.4 慢病毒Lenti-sh3D干擾效果

將病毒液加入HeLa細(xì)胞中，48 h后觀察熒光(圖4C)。再用CVB3感染24 h，收集各組細(xì)胞沉淀，提取蛋白。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖4A、4B)，與對照組Lenti-mock相比，Lenti-sh3D感染組3D聚合酶表達(dá)水平明顯降低(P<0.001)，抑制率約為52%，表明慢病毒包裝成功，且能顯著抑制CVB3 3D聚合酶的表達(dá)水平。

將病毒液經(jīng)腹腔注入小鼠體內(nèi)，5 d后收集心臟組織，提取蛋白。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示(圖4D、4E)，與對照組Lenti-mock相比，Lenti-sh3D感染組3D聚合酶表達(dá)水平降低(P<0.001)，抑制率約為44%。

3 討論

CVB是病毒性心肌炎的主要病原，但致病機(jī)制尚未明確。3D基因編碼RNA依賴的RNA聚合酶，負(fù)責(zé)病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，合成子代病毒基因組，在CVB感染和復(fù)制中發(fā)揮重要作用，選擇3D作為靶基因可為CVB基因治療奠定基礎(chǔ)。目前，干擾靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的網(wǎng)站有GeneLink、IDT、siRNA Wizard等。本研究利用BLOCK-iTTMRNAi Designer公用軟件設(shè)計(jì)出3條siRNA，評分均較高。因此，首先進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，雖然評分較高的幾條siRNA均可有效抑制病毒3D聚合酶的表達(dá)及病毒的復(fù)制，但siRNA-1043抑制效果最顯著，可抑制約50%的3D聚合酶表達(dá)和 43.7% 的病毒復(fù)制，被確定為后續(xù)shRNA的候選序列。由此提示，靶點(diǎn)序列的篩選很重要[14-15]。此外，相對shRNA，siRNA具有易篩選、價(jià)格低的優(yōu)勢，且兩者在靶序列的選擇上具有一致性。因此，本研究針對設(shè)計(jì)軟件提供的多條靶序列首先采用siRNA進(jìn)行篩選，確定最終干擾效率最佳的序列合成shRNA，然后用于慢病毒的制備，既降低了shRNA合成的消耗，又保障了慢病毒的高效性。

慢病毒載體是源于反轉(zhuǎn)錄病毒的載體，其轉(zhuǎn)染效率高，可感染分裂期和非分裂期的細(xì)胞，還可容納較大的基因片段，有良好的科研應(yīng)用價(jià)值。近20年來，RNAi技術(shù)發(fā)展迅速，被廣泛用于一些疾病治療[16-17]。將慢病毒載體用于RNAi技術(shù)，成為基因功能研究和基因治療領(lǐng)域的一種有力手段[18]。

A: Expression of 3D in CVB3-induced HeLa cells after lentiviral infection by Western blotting. B: Quantitative analysis of protein expression.n=3,***P<0.001. C: Expression of green fluorescent protein was observed under fluorescence microscope (200×). D: Expression of 3D in CVB3-induced BALB/c mice after lentiviral infection by Western blotting. E: Quantitative analysis of protein expression.n=3,***P<0.001.

圖4慢病毒Lenti-sh3D干擾效果鑒定

Fig.4InterferenceeffectofLenti-sh3D

本研究成功構(gòu)建了pLVTHM-3DshRNA 重組質(zhì)粒，采用第二代慢病毒包裝系統(tǒng)包裝，成功獲得15 mL慢病毒Lenti-sh3D，收獲的病毒可顯著抑制3D基因的表達(dá)，抑制率約為52%，病毒滴度為5×107TU。

通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)慢病毒載體法還存在很多缺點(diǎn)：①實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞狀態(tài)有很嚴(yán)格的要求。轉(zhuǎn)染慢病毒重組質(zhì)粒時(shí)，需進(jìn)行48～72 h的長期培養(yǎng)，這對細(xì)胞密度和狀態(tài)要求很高。②病毒包裝表達(dá)率不是很高。采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)進(jìn)行慢病毒包裝，細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染效率等因素可能導(dǎo)致病毒滴度不是很高，在10-5稀釋度就觀測不到熒光，需對病毒進(jìn)行純化和濃縮以提高滴度。③保存的病毒在反復(fù)凍融后滴度下降。經(jīng) -80 ℃反復(fù)凍融時(shí)病毒滴度降低很快，建議分裝收集到的上清液。④實(shí)驗(yàn)操作繁瑣，時(shí)間較長。