miR-146a 基因rs2910164 位點基因多態性與慢性阻塞性肺疾病風險相關性

顧桂芳 丁月平

慢性阻塞性肺病（COPD）是一種進行性疾病，其中慢性中性粒細胞炎癥的發生與肺實質（肺氣腫）和小氣道疾病的破壞有關，導致氣流受限和肺功能下降[1-2]。吸入有害物質如香煙煙霧等是COPD 發生的常見危險因素，然而并不是所有的吸煙者都會患COPD，表明COPD 的發生具有遺傳性[3]。miRNAs 是由大約19-25 個核苷酸組成的小型非編碼RNA，通過增加mRNA 的降解或抑制特定mRNA 的蛋白翻譯而導致轉錄后基因的抑制。它們參與各種生物過程，其表達的改變可能導致病理狀況，如肺疾病[4]。本研究的主要目的是分析miR-146a 基因rs2910164位點單核苷酸多態性與血漿中miR-146a-5p 表達水平相關性對COPD 發生風險的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014 年5 月—2017 年10 月期間浙江省紹興市上虞人民醫院和浙江中醫藥大學附屬第二醫院呼吸內科收治的145 例COPD 患者作為研究組。從浙江省紹興市上虞人民醫院和浙江中醫藥大學附屬第二醫院招募145 名健康體檢者作為對照組。本研究方案經醫院倫理委員會審核通過，與所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 納入、排除標準 納入標準：（1）均符合中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組制定的COPD 診治指南（2007 年修訂版）中COPD 診斷標準[5]；（2）患者相互之間無血緣關系；（3）第一秒鐘用力呼氣量占用力肺活量比值（FEV1/FVC）＜70%，并且吸入支氣管舒張劑后FEV1/FVC 仍＜70%。排除標準：（1）患有支氣管擴張、結節病、肺間質纖維化、肺結核、支氣管哮喘、糖尿病、心臟病等疾病；（2）腫瘤患者。

1.3 基因型檢測 所有受試者均取5mL 靜脈血，分離血漿后血細胞用于基因組DNA 提取，血漿保存于-80℃冰箱。血細胞中提取基因組DNA 使用的試劑盒來自天根生化科技（北京）有限公司，批號2014040301。設計miR-146a 基因rs2910164 位點PCR 擴增正向引物序列為5’-GAGGGGTCTTTGCACCATCT-3’；反向序列為5’-CAAGCCCACGATGACAGAGA-3’。以提取的受試者基因組DNA 作為模板，使用生工生物工程（上海）股份有限公司生成的PCR 試劑盒進行PCR 擴增，批號2014110538。PCR擴增后將PCR 產物取10μL 進行商業化測序，供應商為生工生物工程（上海）股份有限公司，測序結果使用Chromas 軟件進行分析，本研究中miR-146a 基因rs2910164 位點不同基因型測序結果見圖1。

圖1 rs2910164 位點不同基因型測序結果

1.4 血漿miR-146a-5p 表達水平檢測 進行RNA提取和實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測血漿miR-146a-5p 表達水平。使用Tri Reagent（Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，USA）根據制造商的說明提取總RNA，使用RevertAid TM 逆轉錄酶試劑盒（K1622，批號2014091302，Fermentas，MA，USA）從總RNA 合成cDNA。使用特異性引物[6]和Maxima TM SYBR Green qPCR Master Mix（K0222，批 號20131205043，Fermentas）進行PCR 擴增，U6 用作miR-146a-5p 表達正常化的內部對照，檢測miR-146a-5p 相對U6 的表達水平。

1.5 血漿IL-8 水平檢測 使用人IL-8 ELISA 試劑盒（Abcam，貨號ab46032，批號2014061304）檢測血漿中IL-8 細胞因子檢測水平。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行，每個樣本做3 個復孔。

1.6 統計學方法 應用SPSS 20.0 軟件。計數資料以率（%）表示，使用χ2檢驗分析組間差異。計量資料的表示方法為均數±標準差（±s），使用t 檢驗和單因素方差分析組間差異。使用非條件Logistic 回歸模型估計比值比（OR）和95%置信區間（CI）。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較 研究組中男86 例，女59例；年齡38～75 歲，平均（56.45±10.85）歲；平均體質指數（BMI）（23.54±2.34）kg/m2。對照組中男88 例，女57 例；年齡40～77 歲，平均（58.31±12.24）歲；平均BMI（23.61±2.54）kg/m2。研究組與對照組年齡、性別、BMI 等一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 兩組miR-146a 基因rs2910164 位點單核苷酸多態性與COPD 風險相關性 研究組和對照組miR-146a 基因rs2910164 位點基因型頻率之間的差異有統計學意義（χ2=15.52，P＜0.01）。以野生型（CC）為標準，雜合子（CG）和純合子（GG）均是COPD 的危險因素（OR=2.40，95%CI=1.42～4.07；OR=3.27，95%CI=1.27～8.57，P=0.01），顯性模型（CG+GG）下COPD風險較高（OR=2.53，95%CI=1.54～4.19，P＜0.001）；隱性模型下患COPD 的風險較低（P=0.07）。以miR-146a 基因rs2910164 位點C 等位基因為參考，突變型等位基因G 是COPD 的高風險因素（OR=1.99，95%CI=1.37～2.89，P＜0.001），見表1。

2.3 兩組血漿miR-146a-5p、IL-8 水平 研究組患者血漿miR-146a-5p 水平顯著低于對照組，血漿IL-8 細胞因子水平顯著高于對照組，差異均有統計學意義（t=14.74，P＜0.01；t=23.67，P＜0.001），見表2。

2.4 不同基因型受試者血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較 野生型（CC）受試者血漿miR-146a-5p 水平顯著高于雜合子（CG），純合子（GG）最低，差異有統計學意義（F=16.75，P＜0.01），而野生型（CC）受試者血漿IL-8 細胞因子水平顯著低于雜合子（CG），純合子（GG）最高，差異也有統計學意義（F=19.37，P＜0.001），見表3。

表1 兩組miR-146a 基因rs2910164 位點基因型和等位基因頻率比較（±s）[例（%）]

表1 兩組miR-146a 基因rs2910164 位點基因型和等位基因頻率比較（±s）[例（%）]

注：OR：比值比；CI：置信區間：CC：野生型；CG：雜合子；GG：純合子；研究組：慢性阻塞性肺疾病患者；對照組：健康體檢者

表2 兩組血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

表2 兩組血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

注：REL：相對表達水平；IL-8：白介素-8；研究組：慢性阻塞性肺疾病患者；對照組：健康體檢者

表3 不同基因型受試者血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

表3 不同基因型受試者血漿miR-146a-5p、IL-8 水平比較（±s）

注：REL：相對表達水平；IL-8：白介素-8；CC：野生型；CG：雜合子；GG：純合子；研究組：慢性阻塞性肺疾病患者；對照組：健康體檢者

2.5 血漿miR-146a-5p 水平與IL-8 細胞因子相關性 相關性分析結果顯示，血漿miR-146a-5p 表達水平與IL-8 細胞因子水平之間呈負相關性（r=-0.63，P＜0.001），見圖2。

3 討論

圖2 血漿miR-146a-5p 水平與IL-8 細胞因子相關性（n=145）注：IL-8：白介素-8

miRNA 是一類豐富的19～25 個核苷酸長左右的非蛋白質編碼RNA，通過與靶基因信使RNA（mRNA）的3'非翻譯區（UTR）結合調節大約三分之一的蛋白質的編碼基因，導致翻譯抑制或mRNA 降解[7-8]。據報道，miR-146a 前體中的多態性（rs2910164）與多種惡性腫瘤有關[9-10]。rs2910164 位點C 等位基因位于前miR-146a 過客鏈上第一個核苷酸約60 個堿基的位置，計算機會預測導致成熟發夾內的錯配。本研究結果顯示，miR-146a 基因rs2910164 位點野生型（CC）受試者血漿miR-146a-5p 水平顯著高于突變型，這種差異至少部分歸因于研究人群的不同遺傳背景[11]。有學者研究miR-146a-5p 在COPD 氣道上皮和肺成纖維細胞之間異常IL-1α 信號傳導中的作用，結果顯示原代人肺成纖維細胞與氣道上皮細胞共培養顯著增加miR-146a-5p 的表達，其完全依賴于上皮衍生的IL-1α[12]。miR-146a-5p 表達具有抗炎作用，通過下調IL-1 途徑下游的白細胞介素-1 受體相關激酶1（IRAK-1）的表達，并隨后減少肺成纖維細胞的IL-8 釋放。本研究結果顯示，COPD 患者血漿miR-146a-5p 水平顯著低于對照組，且血漿IL-8 水平顯著高于對照組，另外分析血漿miR-146a-5p 水平與IL-8 細胞因子水平結果顯示，血漿miR-146a-5p 表達水平與IL-8 細胞因子水平之間呈負相關性，與Osei 等[11]研究結果一致。從本研究結果來看，攜帶rs2910164 位點G 等位基因的人群具有較高的COPD 風險，分析原因筆者認為miR-146a-5p 的誘導在COPD 成纖維細胞中顯著減少，通過負反饋調節導致IL-8 的釋放增加，而IL-8 在COPD 氣道炎癥的發生和發展過程中具有重要作用[12]。

本研究仍有不足之處，首先樣本量較小，沒有就不同COPD 嚴重程度與miR-146a 基因rs2910164位點單核苷酸多態性的相關性進行分析；其次，未能結合環境因素的影響進行分析，忽略了環境因素的影響。