自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響

葉 武 黃勍棟 唐婷玉 葉 芃 杜堅宗

肺癌是危害人類生命和健康的主要惡性腫瘤之一。蓽茇屬于胡椒科植物蓽茇的干燥未成熟或成熟的果穗[1]。蓽茇酰胺是一種中藥單體，存在于蓽茇根，以及瘤突胡椒和長柄胡椒根[2]。近年研究發現，蓽茇酰胺具有抗腫瘤、抗炎、抗血小板凝集、鎮痛、鎮靜、抗真菌、抗血吸蟲、抗焦慮以及抗抑郁等多種藥理作用[3]。本研究旨在探討蓽茇酰胺對肺癌的抗腫瘤作用。

1 實驗材料

1.1 藥 品 蓽茇酰胺（批號S7551）購于美國Selleck chemicals 公司；2'、7'-二氯-熒光素二乙酸酯（DCFH-DA，批號S0033）購于上海碧云天生物技術研究所；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，批號S0077）購于上海碧云天生物技術研究所；3-甲基腺嘌呤（批號S9281）購于美國Selleck chemicals 公司。

1.2 試劑及儀器 CCK-8 溶液（批號C008-3）購于上海七海復泰生物科技有限公司；α-tubulin（批號T5168）購于美國Sigma 公司；微管相關蛋白輕鏈3B抗體（LC3B，批號nb100）購于美國Novus Biologicals公司；ECL 化學發光試劑盒（批號P0018AS）購于上海碧云天生物技術研究所；BD FACS Calibur 流式細胞儀購于美國BD 公司；超微量分光光度計購于美國Thermo Fisher Scientific 公司，凝膠電泳儀購于美國Bio-Rad 公司；化學發光熒光影像分析儀購于日本富士膠片公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 人肺腺癌A549 細胞株（上海中國科學院細胞庫提供）接種于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養基，置于5%CO2，37℃培養箱中培養，2～3 天更換培養基，待細胞密度為80%～90%時，用胰酶消化，進行細胞傳代。待細胞生長狀態良好，進行后續實驗。

2.2 細胞內活性氧水平檢測 實驗分為對照組、蓽茇酰胺組和蓽茇酰胺+NAC 組。對照組采用生理鹽水處理A549 細胞48h，蓽茇酰胺組采用3μM 蓽茇酰胺處理A549 細胞48h，蓽茇酰胺+NAC 組采用3μM蓽茇酰胺和10mM NAC 處理A549 細胞48h。蓽茇酰胺或NAC 處理A549 細胞后，將細胞與10μM DCFH-DA 在37℃下孵育30min。無血清RPMI-1640培養液洗滌細胞。使用BD FACS Calibur 流式細胞儀測定熒光強度，該值代表細胞內活性氧（ROS）水平。

2.3 CCK-8 法檢測細胞活力 實驗分為對照組、蓽茇酰胺組，蓽茇酰胺+NAC 組和3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組。前三組處理同2.2，3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組采用3μM 蓽茇酰胺和3mM 3-甲基腺嘌呤處理A549 細胞48h。將A549 細胞（3000 個/孔）接種于96孔板中，置入培養箱中培養24h 后，加入蓽茇酰胺、NAC 或自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤，采用超微量分光光度計測定在450nm 處各孔的吸光度（OD 值）。

2.4 蛋白質印跡 使用細胞裂解液裂解A549 細胞，BCA 法測定蛋白濃度。取30～60μg 總蛋白，經SDS-PAGE 電泳后轉移至PVDF 膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST 封閉2h，加入α-tubulin 或LC3B，4℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次，將膜置于二抗中，室溫下孵育1.5h，ECL 顯影，置入化學發光熒光影像分析儀曝光，采用Image J 軟件分析目的蛋白的相對灰度，計算公式為：目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

2.5 統計學方法 應用SPSS 20.0 軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計量資料的兩組間均數比較采用Student’s t 檢驗，多組間均數的比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組A549 細胞ROS 水平比較 蓽茇酰胺組A549 細胞ROS 水平顯著高于對照組（P＜0.05），蓽茇酰胺+NAC 組細胞ROS 水平低于蓽茇酰胺組（P＜0.05），與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1、插頁圖1。

圖1 各組A549 細胞ROS 水平比較

表1 各組A549 細胞ROS 水平比較（±s）

表1 各組A549 細胞ROS 水平比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05；ROS：活性氧；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.2 各組細胞活力比較 蓽茇酰胺組細胞活力顯著低于對照組（P＜0.05）。蓽茇酰胺+NAC 組與對照組細胞活力差異無統計學意義（P＞0.05）。蓽茇酰胺與NAC 合用后，細胞活力恢復至用藥前水平，與蓽茇酰胺組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組細胞活力比較（%，±s）

表2 各組細胞活力比較（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05；NAC：N-乙酰-L-半胱氨酸

3.3 各組A549 細胞LC3B-II 表達水平比較 蓽茇酰胺組細胞LC3B-II 表達顯著高于對照組（P＜0.05），蓽茇酰胺與NAC 合用后，LC3B-II 表達下降至用藥前水平。見插頁圖2。

圖2 各組A549 細胞LC3B-Ⅱ表達水平

3.4 3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組LC3B-II 表達顯著低于對照組和蓽茇酰胺組（P 均＜0.05），3-甲基腺嘌呤+蓽茇酰胺組A549 細胞活力顯著低于蓽茇酰胺組（P＜0.05）。見表3、插頁圖3。

表3 3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響（%，±s）

表3 3-甲基腺嘌呤對蓽茇酰胺抗腫瘤作用的影響（%，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與蓽茇酰胺組比較，△P＜0.05

4 討論

蓽茇酰胺屬生物堿類化合物，具有多種藥理學作用。研究表明，蓽茇酰胺選擇性地抑制腫瘤細胞而不影響正常組織[4]。Raj 等[5]研究發現，蓽茇酰胺增加腫瘤細胞的ROS 水平，但是其對正常細胞的ROS 水平無明顯影響。正常細胞基礎代謝水平較低，很少依賴ROS 應激反應途徑。腫瘤細胞產生明顯的氧化應激反應，為適應氧化應激反應，腫瘤細胞啟動抗氧化防御系統，較大程度上依賴ROS 應激反應途徑。因此，蓽茇酰胺選擇性地增加腫瘤細胞ROS 含量，進而抑制細胞增殖和遷移，誘導細胞凋亡[6]。本研究顯示，蓽茇酰胺提高肺癌細胞的ROS 水平，抑制細胞增殖，NAC 與蓽茇酰胺合用能逆轉蓽茇酰胺介導的ROS 含量升高和細胞增殖抑制作用。這提示蓽茇酰胺可能通過調節ROS 依賴途徑抑制肺癌細胞增殖。

自噬是存在于真核細胞內的一種依賴溶酶體途徑的蛋白質和細胞器降解過程。與肺癌、肺動脈高壓、慢性阻塞性肺病、急性肺損傷和呼吸道感染等多種肺部疾病的發生、發展密切相關[5，7]。LC3B 在自噬過程中扮演重要角色，常被作為監測巨自噬發生的特異性標志蛋白[8-9]。本研究顯示，蓽茇酰胺處理肺癌細胞，LC3B-II 表達顯著增加，與NAC 合用逆轉蓽茇酰胺介導的LC3B-II 升高。這提示蓽茇酰胺參與調節ROS 依賴的細胞自噬。

肺癌細胞自噬水平升高，并依賴自噬來維持細胞生長和存活所需的線粒體功能和細胞代謝[10-11]。本研究將自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤處理肺癌細胞，LC3B-II 表達顯著降低。3-甲基腺嘌呤和蓽茇酰胺聯用明顯增強蓽茇酰胺的抗腫瘤作用。

綜上所述，本研究發現蓽茇酰胺通過調節ROS依賴途徑，抑制肺癌細胞增殖，促進細胞自噬。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤降低肺癌細胞自噬，增強蓽茇酰胺的抗腫瘤作用。