甲狀腺乳頭狀癌組織miR-129 表達與臨床病理特征的相關性

李 瀅 劉 芳 馮 利 陳 雙

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的頭頸部腫瘤。甲狀腺癌的病理類型包括乳頭狀癌、未分化癌、髓樣癌及濾泡狀癌，其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的惡性腫瘤，占甲狀腺癌的70%左右[1]。盡管多數患者預后良好，但是仍有一部分PTC 出現高侵襲、早期轉移[2]。因此，開展PTC 相關分子標志物的研究，為臨床早期診斷和治療預后提供新的方法一直是臨床上的研究熱點。目前普遍認為，由正常細胞轉變為癌細胞，累及周圍組織器官或發生遠處轉移是一個及其復雜的基因變化[3]。微小RNA-129（miR-129）是一種內源性單鏈非編碼的小RNA 分子，有調控細胞的生長、分化、增生和凋亡的作用[4]。近年研究發現，miR-129 在結直腸癌、前列腺癌等中呈低表達[5-6]。本研究旨在分析miR-129 在PTC 組織表達及其與臨床病理特征的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010 年11 月—2014 年2 月浙江省臺州恩澤醫療中心（集團）路橋醫院收治的PTC 患者125 例作為研究對象，其中男32 例、女93例，年齡20～75 歲，平均（40.36±8.42）歲。病理分級和臨床TNM 分期參照國際抗癌聯盟第6 版甲狀腺癌分期分級標準[7]：1 級77 例、2 級48 例；臨床TNM 分期：Ⅰ期24 例、Ⅱ期51 例、Ⅲ期35 例、Ⅳ期15 例。本研究經醫院倫理委員會審核通過。患者均知曉本研究內容并簽署知情同意書。

1.2 納入標準（1）均符合國際抗癌聯盟第6 版甲狀腺癌分期分級標準；（2）均進行全甲狀腺切除+患側中央區淋巴結清掃；（3）均經術后病理學確診。

1.3 排除標準（1）有嚴重肝腎功能不全者；（2）合并其他惡性腫瘤者；（3）入院前經過放療或化療等治療者；（4）臨床及隨訪資料不完整者。

1.4 標本采集 選取125 例PTC 并行手術治療患者，收集PTC 癌變組織125 份作為研究組，另在手術過程中收集125 份距離癌組織邊緣5cm 以上正常甲狀腺組織為對照組，兩組組織標本均進行miR-129水平的檢測。

1.5 定量聚合酶鏈反應（qPCR）檢測甲狀腺乳頭狀癌組及癌旁組織miR-129mRNA 表達 采用TRIzol[賽墨飛世爾科技（中國）有限公司，批號ab49534]提取0.3g 甲狀腺癌組織及癌旁組織總RNA。使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis 試劑盒（美國Life Technologies 公司，批號C120835）產生第一鏈互補（c）DNA。使用GAPDH 進行標準化（GAPDH 正向引物5'-CTCGCTTCGGC-AGCACA-3'；反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'）。PCR 引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司提供并合成，序列如下：miR-182 正向引物：5'-CTTGCTATACAAGGGCAAGCACGAA-3'，反向引物：5'-CTTGAGTACGACCAAATCCCGTC-3。具體操作：將2μL RNA 與1μloligo（dT）和10μL 無RNase 的去離子水混合，在PCR 機中在70℃下孵育5min 并立即在冰上冷卻。通過加入4μL 5X 緩沖液，2μL 10mM 脫氧核糖核苷酸三磷酸，1μL RNA 抑制劑和1μL 逆轉錄酶誘導cDNA 合成，然后在PCR 機中于42℃溫育1h。通過在70℃溫育5min 終止反應。使用THUNDERBIRDS YBR qPCR Mix 試劑盒（日本Toyobo Co，Ltd，Tokyo，Japan公司，批號6514）進行定量測量。對于PCR，將12.5μL 2XqPCR Mix，2.0μL 每 種 引 物（2.5μM），2.0μL cDNA 和8.5μL 雙蒸水加入0.2mL PCR 管中。擴增條件包括40 個循環，95℃，15min，95℃，15s，55℃，30s，72℃，25s。然后將反應保持在4℃。使用閾值循環（Ct）的值確定每個靶基因的mRNA 表達。在與GAPDH 比較后使用2-ΔΔCT 方法計算相對表達。

1.6 統計學方法 應用SPSS 20.0 軟件進行數據統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，計數資料以率（%）表示，兩組間采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier 法估計不同臨床特征PTC 患者的生存情況，通過非條件單因素和多因素Cox 比例風險回歸模型分析影響PTC 患者預后的相關因素，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組組織標本miR-129mRNA 表達水平比較PTC 患者其PTC 癌變組織miR-129 mRNA 表達水平低于癌旁正常組織[（0.66±0.21）比（1.89±0.48），P＜0.01]。

2.2 不同臨床特征PTC 患者甲狀腺癌組織miR-129 表達比較 根據ROC 曲線取miR-129 mRNA=0.49 時，約登指數最大為0.38。因此，miR-129 mRNA=0.49 時作為診斷PTC 的截點，miR-129 低表達患者（≤0.49）33 例（26.40%），miR-129 高表達患者（＞0.49）92 例（73.60%）。miR-129 的表達與PTC 患者其年齡、性別、腫瘤大小情況均無明顯關系（P＞0.05），miR-129 的表達與PTC 患者臨床分期、淋巴結轉移及病理分級的表達有顯著關系（P＜0.001、P＜0.001、P=0.018），見表1。

表1 不同臨床特征的PTC 患者其miR-129 表達情況比較[例（%）]

2.3 PTC 患者預后生存情況 本研究125 例PTC患者中，自出院后至隨訪結束存活4～60 個月，5 年生存率50.40%（63/125）。其中miR-129 高表達和低表達患者5 年總生存率分別為72.73%（24/33）和42.39%（39/92），經統計學分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 影響PTC 患者預后的單因素分析 經單因素分析得出：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達時患者生存時間均顯著縮短（P＜0.05），見表2。

2.5 影響PTC 患者預后Cox 多因素分析 經多因素Cox 比例風險回歸模型分析得出：臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移、病理分級2 級及miR-129 水平低表達均為影響PTC 患者預后的獨立危險因素（P＜0.001），見表3。

3 討論

機體內的細胞因子和基因的表達與患者治療及預后情況密切相關[8]，故尋找影響患者病情進展和預后的相關因素是改善PTC 患者預后的關鍵。miRNA是一類長度為20～24nt 的單鏈非編碼微小RNA，廣泛存在于動植物中。腫瘤細胞組織miRNA 基因的改變存在多樣化，主要以基因缺失、過表達及基因擴增為主[9]。研究表明，miRNA 在細胞或組織中可充當抑癌基因或者促癌基因的角色，直接影響腫瘤的發生、發展[10]。相關研究證實，miR-34、miR-1301、miR-19等在PTC 異常表達，對PTC 患者造成嚴重影響[11-12]。

表2 影響PTC 患者預后的單因素分析

本組研究中，PTC 癌變組織miR-129 表達低于癌旁正常組織，患者臨床分期越高、有淋巴結轉移、病理分級越高其miR-129 低表達率明顯升高，這提示miR-129 在機體中的表達與PTC 的發生和疾病進展有密切關系。于浩等[13]研究表明，miR-129 在膀胱癌組織呈低表達水平，且支持miR-129 可能成為膀胱癌診斷的無創腫瘤標記物，可用于早期診斷及預后判斷和復發的預測。潘印等[14]研究顯示，在前列腺癌患者，miR-129 在腫瘤低分化、病理分期越高中呈低表達。本研究結果與上述結果一致，進一步證實miR-129 參與腫瘤的發生、發展。多因素Cox 回歸分析顯示，臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結轉移及病理分級2 級及miR-129 低表達均為PTC 患者預后獨立危險因素（P＜0.05）。既往研究表明，張力蛋白同源的基因、人類第10 號染色體缺失的磷酸酶及程序性細胞死亡因子4、肌球蛋白1 等在惡性腫瘤形成過程中起重要作用的抑癌基因，均為miR-129 的下游靶基因，通過調控這些下游靶基因，進而調控這些因子所在的信號傳導通路，從而在惡性腫瘤的發生和進展中起促進作用[15]。由此可見，miR-129 在PTC 患者疾病的發生、進展以及預后中有著重要的影響，因此，miR-129 可作為判斷甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及預后的生物標志物，臨床上檢測miR-129 表達水平，預測PTC 患者的預后情況。

表3 影響PTC 患者預后Cox 多因素分析

綜上所述，在PTC 癌組織miR-129 以較低水平表達，隨患者臨床分期越高、有淋巴結轉移、病理分級越高時其表達率均上升。miR-129 表達水平與腫瘤的進展程度和惡性程度呈負相關，miR-129 低表達PTC患者預后相對較差，檢測miR-129 表達水平有利于PTC 的診斷及預后評價。但本組研究所選樣本量較少及研究及隨訪時間過短，對于miR-129 的表達是否受其他因素影響尚未明確，需進一步深入研究。