鼠抗人CD28單克隆抗體的制備及體外生物學(xué)活性的初步研究①

沈立軍 孔 永 顏天銘 王玉玉 王 婧 邱玉華

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)系，蘇州215123)

T細(xì)胞表達(dá)的CD28是迄今公認(rèn)的經(jīng)典共刺激信號B7/CD28通路的重要組成分子[1,2]，在T細(xì)胞對抗原的特異性免疫應(yīng)答中,CD28分子作為受體與APC表達(dá)的天然配體B7-1、B7-2相互作用后,介導(dǎo)T細(xì)胞活化所需的協(xié)同刺激信號。該信號能增加IL-2分泌促進(jìn)活化、存活以及延緩T細(xì)胞失能[3,4]。對該信號進(jìn)行靶向調(diào)控，可促進(jìn)機(jī)體對腫瘤的排斥和腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而具有潛在的應(yīng)用價值。

本研究利用本室構(gòu)建保存的鼠抗人CD28單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，制備CD28單抗，采用Protein A免疫親和層析法獲得純化抗體，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行分子和細(xì)胞水平的研究，分析其與重組及天然CD28的結(jié)合活性，結(jié)合動力學(xué)特性，以及對T細(xì)胞增殖的影響，以評價該抗體的體外生物學(xué)活性，并為后續(xù)體內(nèi)研究提供研究材料和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑、儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Hyclone；ProteinA親和層析柱購自Merck；人CD28-小鼠IgG2a-Fc、人CD28-His購自ACROBiosystems；Zeba Spin Desalting Columns(7K MWCO)、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin、SA-HRP、小鼠抗人CD3激發(fā)抗體購自Thermo；TMB顯色液購自KPM；PE標(biāo)記的小鼠抗Biotin抗體購自Biolegend；Histopaque-1077淋巴細(xì)胞分離液、降植烷(Pristane)購自Sigma-Aldrich；CellTiter-Glo Lumine-scent Cell Viability Assay購自Promega。Biacore(T200)、蛋白純化儀(AKTA explover 100)、Series S Sensor Chip CM5購自GE公司；尼龍毛柱購自Polysciences；高效液相色譜儀購自Waters；流式細(xì)胞儀(FACSAriaⅢ)購自BD；酶標(biāo)儀購自Molecular Devices。

1.1.2細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)動物 能穩(wěn)定分泌鼠抗人CD28單抗的雜交瘤細(xì)胞株6E8由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；Jurkat購自ATCC，由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)系本課題組保存并常規(guī)傳代培養(yǎng)；3～5周齡健康雌性裸鼠(BALB/c-nu)購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)動物管理中心SPF級動物房。……