一株黑木耳綠霉病病原真菌的分離鑒定及其殺菌劑的篩選*

楊 武，羅深喜，夏志蘭，徐志偉，羅 坤，**

（1.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2.湖南省漢壽縣洲口鎮農業站，湖南 漢壽 415918；3.湖南農業大學食用菌研究所，湖南 長沙 410128；4.湖南農業大學東方科技學院，湖南 長沙410128）

黑木耳（Auricularia auricula） 含有蛋白質、多酚、多糖等多種營養成分，是1種營養豐富的藥食同源食用菌[1-2]。中國是世界上黑木耳栽培的起源地，距今已有1 400多年的栽培歷史，目前總產量已達世界的90%以上[3]。近年來，黑木耳生產規模越來越大，各地黑木耳菌包廠如雨后春筍般出現，并朝著專業化分工、大型機械化生產、自動化及智能化控制方向發展[4]。但是，由于單片木耳栽培技術還不成熟，栽培生產過程中經常出現各種問題，其中細菌性病害和以鏈孢霉、綠霉等為主的真菌性病害，嚴重影響黑木耳的產量和品質[5-7]。在國外也有類似的問題，早在1985年，綠色霉菌在北愛爾蘭開始流行，并迅速蔓延橫跨歐洲的農場；此外，在美國和加拿大的蘑菇栽培中也有類似病狀的出現，嚴重影響食用菌的生產[8-9]。

木霉屬真菌可以產生纖維素酶、果膠酶等酶類，可用于紡織業的纖維處理、去污劑生產以及動物飼料加工等，同時對多種病原真菌有拮抗作用，已成為國內外的研究熱點[10]。然而，部分木霉可產生胞外酶、有毒物質、次生代謝產物，引起黑木耳等食用菌的綠霉病，影響食用菌的生長；該病害在食用菌生產過程中普遍發生，給食用菌的栽培帶來災難[11-12]。王晶[13]通過對北京、河北、山東、遼寧、黑龍江五省的食用菌發病情況的調查，發現在食用菌栽培過程中，侵染性病害主要以細菌性褐斑病為主，競爭性病害主要以木霉病為主。崔麗紅[14]在貴州和遼寧兩省6個地區采集了黑木耳（Auricularia auricula）、海鮮菇（Auricularia auricular）、灰樹花（Grifola frondosa）、香菇 （Lentinula edodes）、和金針菇（Flammulina velutipes） 等7種食用菌的感病栽培菌棒樣本61份，經分離純化發現，木霉屬真菌是感染食用菌的優勢病原菌，其次為青霉屬（Penicliilum）真菌、曲霉屬 （Aspergillus） 真菌、鐮孢菌屬（Fusarium） 真菌，共占分離出的病原菌菌株的71.36%。

雖然黑木耳主要產自東北三省、河南、河北、山東等北方地區，但湖南多地的氣候也適合栽培黑木耳。然而，在“北耳南移”過程中，由于湖南大部處于丘陵地帶，氣候潮濕，黑木耳的栽培過程中容易產生病害，這一問題成為該產業在南方發展的絆腳石。以懷化地區為例，筆者前期研究發現黑木耳生產過程中出現過青霉（Penicillium paneum）、木霉 （Trichoderma longibrachiatum） 及毛霉 （Exserohilum turcicum） 等病害，其中木霉危害最為嚴重，有的地塊污染率達到50%以上，嚴重威脅到黑木耳的正常生產。針對這一問題，筆者從懷化地區采集黑木耳罹病樣品，通過對病原菌進行分離鑒定，對其殺菌劑進行篩選，旨在為防治當地黑木耳的綠霉病提供一定指導。

1 材料與方法

1.1 材料

罹病黑木耳樣品收集自湖南省麻陽縣；供試食用菌（杏鮑菇、靈芝、大球蓋菇、雙孢蘑菇、姬松茸、秀珍菇）菌種均由湖南農業大學食用菌研究所提供；供試真菌的培養使用馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養基；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術有限公司進行；供試殺菌劑詳見表1。

表1 殺菌劑種類Tab.1 Types of fungicide

1.2 病原真菌的分離與純化

1.3 病原真菌的鑒定

1.3.1 病原菌培養性狀的觀察

將保存于冰箱的病原菌菌株進行活化，待菌落長滿培養皿后，用打孔器打取組織塊于新的PDA培養基中央，置于28℃培養箱中培養，每隔12 h觀察菌落形態，記錄菌絲的厚薄、疏密和顏色變化，并測量菌落直徑，

1.3.2 病原菌形態學鑒定

挑取活化的病原菌于PDA培養基上培養，待菌落變綠時進行臨時片的制作，在顯微鏡下觀察并記錄分生孢子梗和分生孢子的顏色、大小等特征。木霉的鑒定參照崔麗紅[14]和吳小平[15]等資料進行。

1.3.3 病原菌分子生物學鑒定

菌株AD092基因組DNA的提取：病原真菌基因組DNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提盒進行。

ITS序列的PCR擴增、片段回收和序列測定：選用正向引物 ITS 1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 反 向 引 物 ITS 4： 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；以基因組DNA為模板。擴增條件為94℃預變性4 min；94℃變性45 s，55℃復性45 s，72℃延伸 1 min，30個循環；72℃延伸 10 min。反應體系為25 uL。采用1%瓊脂糖電泳對擴增產物進行檢測，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行PCR擴增產物的回收。待產物回收后，送至上海生工進行序列的測定。

本文從不同角度對廣西與東盟國家跨境貿易發展及跨境人民幣結算現狀進行深入分析。同時，選取當年累計出口額、當年累計進口額及跨境人民幣結算量等具有代表性的指標，運用協整檢驗、構建VAR模型和脈沖響應函數等分析方法，對廣西跨境人民幣結算ln（crmb）與廣西—東盟進出口貿易ln（ix）、ln（ex）三個指標變量的關系進行實證分析。

序列分析及系統發育分析：將測序獲得菌株的ITS序列與NCBI中GenBank數據庫中核酸序列進行比對，通過 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析其與已知序列的相似度，推測菌株AD092的屬種，結合MEGA 7軟件進行系統發育分析，構建菌株的系統進化樹。

1.4 病原真菌致病性回接

將病原真菌接種于PDA培養基上于28℃培養5 d，用無菌水將孢子洗脫后用3層紗布過濾，制成病原真菌孢子懸浮液備用。

取健康的黑木耳菌袋，無菌條件下將病原真菌孢子懸浮液噴灑于菌袋頂部，用等量無菌水作為對照，各設置3個重復，置于25℃、RH為60%的條件下培養，每天觀察發病情況并做好記錄，菌袋發病后，再次分離培養病原菌，與原接種病原菌菌株進行比較，確定致病病原菌。

1.5 長枝木霉對不同食用菌的侵染能力

鑒于食用菌菌絲比病原真菌菌絲生長慢，因此先用無菌的7 mm打孔器將活化好的6種食用菌菌絲打出大小一致的組織塊，在平板一側接種。待靈芝生長2 d，杏鮑菇生長4 d，雙胞蘑菇、木耳及秀珍菇生長5 d，姬松茸生長6 d后，分別在平板另一側接種病原菌。觀察菌絲交接處食用菌菌絲的生長情況，判斷長枝木霉對不同食用菌的侵染能力[15]，每個處理設3個重復。

1.6 幾種殺菌劑的抑菌活性

采用菌絲生長速率法[16]進行抑菌效果的測定。選取表1中的4種殺菌劑，將100 mg·L-1的母液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的濃度進行稀釋后倒入約12 mL PDA培養基（55℃左右），每皿加入1 mL上述藥液混勻，制成平板。冷卻后，每皿中央接種長枝木霉菌餅（直徑7 mm），以水作為對照（CK），每個處理設3個重復，置于培養箱中28℃培養，待CK菌落長滿整個平板的2/3時，用十字交叉法測定菌落直徑，抑菌率（P，%）計算公式為：

式中：R1（mm） 表示對照菌落直徑；R2表示處理菌落直徑（mm）；R表示菌餅直徑（mm）。

2 結果與分析

2.1 病原真菌的分離與純化

從采集地收集的污染菌袋中，分離得到1個菌株，活化2次～4次后，置于PDA斜面培養基中培養2 d，后轉至4℃冰箱保存。

2.2 病原真菌的分類鑒定

2.2.1 菌株AD092的形態特征和培養性狀

菌株AD092的生長速度見圖1、形態特征見圖2。

圖1 菌株AD092菌落生長速度Fig.1 Growth rate of colony of strain AD092

圖2 長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of Trichoderma longibrachiatum

結合圖1和圖2分析，菌株AD092在PDA平板上生長0.5 d時菌落直徑達1.97 cm，0.5 d～2.5 d為快速生長期，培養2.5 d菌落直徑達到最大，為8.5 cm，4 d時菌落已全部老熟，由白色轉變為綠色，且常出現“膿泡”狀結構，即分生孢子梗叢束，菌絲似氈狀。分生孢子梗長且較直，次級分枝通常較短，呈直角狀伸出，但基部的次級分枝較長，常單個生出或互生，幾乎不會再次分枝。瓶梗單生或2個～6個輪生，基部略微變細，呈圓柱狀，頂部明顯變細，頂端瓶梗基部不溢縮，其下著生很多間生瓶梗。分生孢子單孢無色，呈倒卵形或橢圓形，大小為 （2.3～3.1） μm × （3.9～5.5） μm。

2.2.2 菌株AD092的分子生物學鑒定

菌株AD092的分子生物學分析結果見圖3、圖4。

圖3 菌株AD092的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain AD092

由圖3可知，菌株AD092的ITS序列全長為572 bp，通過BLAST比對發現，AD092與長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 的相似度最高，相似性為99%。

圖4 菌株AD092的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain AD092

由圖4可知，將菌株的ITS序列與BLAST搜索到的相近菌株進行比較，結合Mega 7軟件構建系統發育樹，結果表明，菌株AD092與長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）位于同一分枝上，相似度最高，結合形態特征與培養性狀分析，將其鑒定為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

2.3 菌株AD092的致病性回接

菌株AD092的致病性回接試驗結果見圖5。

由圖5可知，將分離純化的AD092菌株回接到黑木耳菌袋上，觀察發現黑木耳菌袋頂部覆蓋一層深綠色霉，這一癥狀與采集回來的菌袋癥狀一致。將該菌袋中的病原菌進一步分離純化，發現該菌的菌落形態與菌株AD092的一致，初步判斷長枝木霉是黑木耳綠霉病的致病菌。

圖5 菌株AD092的致病性回接Fig.5 Pathogenicity inoculation of strain AD092

2.4 長枝木霉對不同食用菌的侵染能力

平板對峙試驗表明，長枝木霉對不同食用菌侵染能力不同。對靈芝、姬松茸和大球蓋菇侵染能力強，木霉菌絲逐漸蔓延至交接處，并且能夠侵入其菌絲，導致其菌絲的枯萎死亡。對黑木耳、杏鮑菇和秀珍菇侵染能力中等，木霉菌絲能夠蔓延至交接處但不繼續侵入，交接處食用菌菌絲變黃枯萎。

2.5 幾種殺菌劑的抑菌活性

目前為止，在食用菌生產過程中運用的化學藥劑種類較少，本文選取了4種常見的殺菌劑進行抑菌試驗，結果見表2。

表2 4種殺菌劑對長枝木霉的抑菌活性測定Tab.2 Determination of inhibitory activity of 4 fungicides against Trichoderma longibrachiatum

由表2可知，在4種殺菌劑中咯菌腈對長枝木霉的抑菌效果最好，10-1稀釋液抑菌率高達97.8%，稀釋濃度為10-2和10-3時，抑菌率分別達到了96.7%、95.6%；其次是多菌靈，10-1稀釋液抑菌率為68.9%，但稀釋濃度為10-2、10-3、10-4、10-5時抑菌效果較差；其他藥劑基本上沒有抑菌功能。

3 結論與討論

從懷化市麻陽縣采集的30個染病的黑木耳菌袋中，分離出1種病原真菌，通過進行形態學、培養特性觀察和ITS序列分析，鑒定為長枝木霉。以長枝木霉為指示菌對7種食用菌進行平板對峙，結果表明，長枝木霉對不同食用菌侵染能力不同，大部分食用菌在受到木霉感染后，生長緩慢甚至停滯，嚴重影響產量和品質。選用食用菌生產中常用的殺菌劑進行抑菌活性試驗，發現咯菌腈對木霉的抑制效果最好，稀釋液稀釋濃度為10-1時抑菌率達97.8%，其次為多菌靈，稀釋濃度為10-1時抑菌率達68.9%。

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、康氏木霉 （Trichoderma koningii）是污染食用菌的常見木霉種，不同地區致病率稍有差異[13]。吳小平[15]從福建省、浙江省等地分離得到4種木霉屬真菌，其中哈茨木霉和長枝木霉致病率最高，共達88%。顏一紅[17]從福州、古田等地分離得到7種木霉屬真菌，其中長枝木霉致病率為19.78%，僅次于康氏木霉。

由于食用菌與許多病原菌及雜菌有同源性，且病原菌及雜菌一般具有繁殖快、競爭力強的特點，伴隨著食用菌生產的每個環節，因此目前還沒有真正有選擇性的殺菌劑可供使用[18-19]。劉仁奎[15]通過苯醚甲環唑、多菌靈、百菌清、嘧菌酯、溴菌腈、異菌脲及納他毒素對哈茨木霉的防效比較得出，納他霉素對哈茨木霉具有較好的防效，而且納他霉素作為一種安全的食品添加劑，具有低劑量、高防效及抗菌時間長的優點，適宜做為食用菌生產中哈茨木霉病害防治的藥劑。李晶等[20]研究了7種常見的殺菌劑對菌草食用菌4種病原真菌的室內毒力測定，結果表明百菌清對哈茨木霉的抑制作用最好，而多菌靈對側耳木霉的抑制作用最好，說明不同病原菌對殺菌劑的敏感性不同，在進行多病害防治時應選擇殺菌廣譜、毒性低、效果顯著的農藥。

木霉具有適應性強，傳播蔓延快的特點[21]一旦發生，后果嚴重。本試驗發現，咯菌腈對長枝木霉的防治效果較好，稀釋濃度為10-1～10-3的稀釋液對菌絲生長的抑制率均達到90%以上，可在源頭上抑制木霉的傳播與蔓延，將病害限制在極小范圍內。同時，量少且防效顯著，減少產量損失。

目前，咯菌腈在菌袋上的防效試驗正在開展。而對咯菌腈有效成分的提取、結構鑒定、抑菌機理以及與其他殺菌劑的混用效果有待進一步研究，從而為黑木耳綠霉病的有效防治奠定基礎。