HPLC-DAD-MS-DPPH在線篩選與定性黑脈羊肚菌抗氧化活性成分*

游金坤，嚴(yán) 明，莊陽(yáng)秋，吳素蕊，崔佳麗

（1.中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2.云南省藥物研究所，云南 昆明 650111）

黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps） 又稱小尖羊肚菌，是野生名貴食（藥） 用菌[1]，其營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多種礦物質(zhì)及豐富的脂肪酸[2]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，羊肚菌有降血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞、抗輻射、抗腫瘤等作用[3-7]。目前，關(guān)于羊肚菌的研究多集中于多糖、無(wú)機(jī)元素及菌絲培養(yǎng)[8-10]。針對(duì)黑脈羊肚菌抗氧化活性成分的研究報(bào)道較少。前期研究結(jié)果表明，黑脈羊肚菌具有良好的抗氧化活性，主要成分為水溶性小分子極性化合物，以水提取部位含量最為豐富[11]，但對(duì)于該化合物的定性分析尚未見報(bào)道。

本試驗(yàn)中，通過(guò)HPLC-DPPH在線檢測(cè)法，篩選黑脈羊肚菌不同提取物的抗氧化活性成分，并應(yīng)用UPLC-Q Exactive超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)篩選所獲得抗氧化成分進(jìn)行定性分析，以期建立直觀、快速、準(zhǔn)確并適用于復(fù)雜天然產(chǎn)物中抗氧化活性成分快速篩選與定性的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑脈羊肚菌由中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所提供；固相萃取小柱，Waters Oasis HLB，美國(guó)；DPPH，優(yōu)級(jí)純，美國(guó)Sigma公司；甲醇，色譜純，美國(guó)Merck公司；甲醇，質(zhì)譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；甲酸，色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯甲烷、無(wú)水乙醇，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；超純水，自制。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀，Agilent 1200 Series，美國(guó) Agilent公司；Chemstation B.03.02色譜工作站；中壓恒流泵，同田生物科技有限公司；反應(yīng)圈：PEEK管（長(zhǎng) 5.000 m，內(nèi)徑 0.250 mm）；液質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo Q Exactive，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；分析軟件為Xcalibur 4.0；電子分析天平，DV215CD，美國(guó)OHAUS公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，N-1100，東京理化器械株式會(huì)社；超純水機(jī)，ELIXTM+Milli-Qsynthesis，美國(guó) Millipore公司等。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)裝置流程圖

參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，設(shè)計(jì)HPLC-DPPH在線檢測(cè)黑脈羊肚菌抗氧化活性部位試驗(yàn)裝置流程圖如圖1。

圖1HPLC-DAD-MS（路徑A） 和HPLC-DPPH/ABTS（路徑B）在線快速檢測(cè)黑脈羊肚菌抗氧化成分方法示意圖Fig.1 Schematics of HPLC-DAD-MS(Line A)and HPLCDPPH/ABTS(Line B)for rapid detection of antioxidants in Morchella angusticeps

由圖1可知，試驗(yàn)流程體系路徑分別為A路徑（HPLC-DAD分析系統(tǒng)）和B路徑（DPPH自由基清除檢測(cè)系統(tǒng)）。A路徑中，待測(cè)樣品由路徑A進(jìn)入液相色譜，檢測(cè)獲得原樣品的色譜圖。B路徑中，液相色譜流動(dòng)相與DPPH自由基溶液經(jīng)T形連接管處混合，二者共同進(jìn)入長(zhǎng)5.000 m、內(nèi)徑0.250 mm的PEEK管反應(yīng)線圈中并于其中充分反應(yīng)，DAD檢測(cè)器檢測(cè)獲得樣品反應(yīng)后的色譜圖。抗氧化活性化合物與DPPH反應(yīng)使其吸收減弱從而出現(xiàn)倒峰，即可通過(guò)二者對(duì)比篩選獲取抗氧化活性成分。

1.3.2 樣品處理

黑脈羊肚菌水提物：取黑脈羊肚菌約50 g，用200 mL的超純水超聲提取1 h，取濾液，重復(fù)3次，合并3次的濾液，60℃水浴旋蒸，冷凍干燥備用。

黑脈羊肚菌50%乙醇提取物：95%乙醇提取物溶劑分別為50%乙醇、95%乙醇，其余提取、濃縮、干燥步驟同水提物。

黑脈羊肚菌三氯甲烷提取物：溶劑為三氯甲烷，提取步驟同水提物，旋蒸濃縮浸膏其余提取步驟同水提物，合并3次的濾液，40℃水浴旋蒸，濃縮成為浸膏備用。

分別稱取水提物、50%乙醇提物、95%乙醇提物100 mg，少量超純水溶解后，上樣至HLB固相萃取小柱，先用100 mL超純水進(jìn)行洗脫，再用100 mL的甲醇洗脫，收集洗脫液，60℃水浴旋蒸，分別對(duì)應(yīng)以超純水、50%乙醇提物、95%乙醇提物溶解并定容至10 mL容量瓶中，0.22 μm濾膜過(guò)濾備用。另取氯仿總提物100 mg，以色譜純甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，0.22 μm濾膜過(guò)濾備用。

DPPH溶液配制：精密稱定DPPH標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，以無(wú)水乙醇溶解，定容于1 000 mL棕色容量瓶中，即得濃度為10.00 μg·mL-1DPPH自由基溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 色譜條件

1） 路徑A條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq（250.0 mm×4.6 mm，5.0 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為 30℃；進(jìn)樣量為 15.0 μL。

2） 梯度洗脫條件

梯度洗脫條件具體見表1、表2。

表1 水提物、50%乙醇提物、95%乙醇提物色譜洗脫梯度Tab.1 Chromatographic elution gradient of water extract,50%ethanol extract and 95%ethanol extract

表2 三氯甲烷提取物色譜洗脫梯度Tab.2 Chromatographic elution gradient of trichloromethane extract

3） 路徑B條件

色譜條件與路徑A條件一一對(duì)應(yīng)，DPPH自由基流速為0.4 mL·min-1，DAD檢測(cè)波長(zhǎng)為517 nm。

1.3.4 抗氧化活性成分篩選

由于路徑B較路徑A的反應(yīng)線圈長(zhǎng)5.000 m，路徑B的色譜圖橫軸檢測(cè)時(shí)間有所延遲，故需對(duì)路徑B的色譜圖檢測(cè)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。B路徑色譜圖橫軸時(shí)間需延后值（T，min）的計(jì)算公式為：

式中：V為反應(yīng)線圈容積（mL）；v為反應(yīng)液流速（mL·min-1）。

本研究反應(yīng)線圈長(zhǎng)5.000 m、內(nèi)徑0.250 mm，即反應(yīng)線圈的容積為0.245 mL，因路徑A流速為是1.000 mL·min-1，路徑 B 的流速為 0.400 mL·min-1，即總流速為1.400 mL·min-1，即B路徑延遲需校正時(shí)間T為0.175 min。

1.3.5 質(zhì)譜定性分析

1） 色譜條件

色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell 120 SB-Aq（100.0 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流速為 0.15 mL·min-1；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10.00 μL。

2） 梯度洗脫條件

質(zhì)譜定性分析中梯度洗脫條件具體見表3。

表3 水提物、50%乙醇提物、95%乙醇提物、三氯甲烷色譜洗脫梯度Tab.3 Chromatographic elution gradient of water extract,50%ethanol extract,95%ethanol extract and trichloromethane extract

3）質(zhì)譜全掃描條件

ESI正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)，掃描方式采用Full Mass模式。正離子：噴霧電壓3.50 kV，傳輸毛細(xì)管溫度350℃，離子源溫度350℃，鞘氣和輔助氣分別為35和15，S-lens RF電壓為50 V；分辨率70 000，自動(dòng)增益控制（AGC） 和離子注入時(shí)間（IT） 分別為3e6和50 ms，掃描范圍（scan range） 為m/z 75～1 125。負(fù)離子：噴霧電壓2.50 kV，傳輸毛細(xì)管溫度350℃，離子源溫度350℃，鞘氣和輔助氣分別為35和15，S-lens RF電壓為50 V；分辨率35 000，自動(dòng)增益控制（AGC） 和離子注入時(shí)間（IT） 分別為3e6和50 ms，掃描范圍為m/z 75～1 125。噴霧氣為氮?dú)猓鲎矚鉃楦呒兊獨(dú)狻?/p>

4）質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴性子離子掃描條件

ESI正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)，掃描方式采用Full Mass/dd-MS2模式；正負(fù)離子檢測(cè)的離子源參數(shù)與同F(xiàn)ull Mass模式相關(guān)參數(shù)與質(zhì)譜Full Mass條件一致。正離子：dd-MS2模式，分辨率17 500，自動(dòng)增益控制（AGC） 和離子注入時(shí)間 （IT） 分別為1e5和50 ms，離子篩選窗口為m/z 4.0，掃描范圍為m/z 50～1125，碰撞能量30 V。負(fù)離子：dd-MS2模式，分辨率17 500，自動(dòng)增益控制（AGC） 和離子注入時(shí)間（IT） 分別為1e5和50 ms，離子篩選窗口為m/z 4.0，掃描范圍為m/z 50～1 125，碰撞能量35 V。噴霧氣為氮?dú)猓鲎矚鉃楦呒兊獨(dú)狻?/p>

1.3.6 抗氧化活性成分定性分析

通過(guò)HPLC-DPPH在線檢測(cè)法獲得篩選抗氧化活性成分的正確指認(rèn)及峰定位，并應(yīng)用UPLC-Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀的全掃描模式及質(zhì)譜全掃描/數(shù)據(jù)依賴性子離子掃描模式對(duì)篩選所獲得抗氧化成分進(jìn)行定性分析，獲得其精確分子量及其特征模式下產(chǎn)生的碎片離子，應(yīng)用Xcalibur 4.0計(jì)算其可能的化學(xué)組成（誤差小于5×10-6）并推測(cè)分子式，應(yīng)用HighChem Mass Frontier 7.0庫(kù)搜索抗氧化活性成分并定性或通過(guò)其特征碎片離子峰信息、歸屬信息以及已有的相關(guān)化學(xué)成分信息報(bào)道，推斷其可能的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC-DPPH在線抗氧化活性成分篩選結(jié)果

HPLC-DPPH在線抗氧化活性成分篩選結(jié)果如圖 2～圖 5。

圖2 水提物HPLC-DPPH在線分析Fig.2 On-line HPLC-DPPH analysis of water extracted

圖350%乙醇提取物HPLC-DPPH在線分析Fig.3 On-line HPLC-DPPH analysis of 50%ethyl alcohol extracted

圖4 95%乙醇提物HPLC-DPPH在線分析Fig.4 On-line HPLC-DPPH analysis of 95%ethyl alcohol extracted

圖5 三氯甲烷提取物HPLC-DPPH在線分析Fig.5 On-line HPLC-DPPH analysis of trichloromethane extracted

由圖2～圖5可知，對(duì)比路徑A所獲得原色譜圖與路徑B所獲得反應(yīng)色譜圖，抗氧化活性成分篩選結(jié)果表明，水提物得到的抗氧化成分最多，為3個(gè)；50%乙醇、95%乙醇提取物得到的抗氧化成分均為1個(gè)，且該成分與水提取物中1號(hào)峰出峰時(shí)間一致，因色譜條件一致，故可判斷為該成分與水提取物中1號(hào)峰為同一抗氧化活性成分；三氯甲烷提取物中未篩選獲得抗氧化成分。

因倒峰面積與抗氧化活性能力強(qiáng)弱呈正相關(guān)，故可判斷水提取物中篩選獲得抗氧化活性成分3的抗氧化活性較優(yōu)；50%乙醇提取物及95%乙醇提取物中篩選獲得抗氧化活性成分1，即水提取物中抗氧化活性成分1，其抗氧化活性較優(yōu)；而水提取物中篩選獲得抗氧化活性成分2的抗氧化成分活性均較弱。

經(jīng)篩選，獲得3個(gè)抗氧化活性成分，均可于水提取物中篩選獲得，故后續(xù)3個(gè)化合物抗氧化活性成分定性分析僅分析黑脈羊肚菌水提取物即可。

2.2 UPLC-QE在線抗氧化活性成分定性分析結(jié)果

質(zhì)譜全掃描結(jié)果見圖6～圖8，由圖中結(jié)果可獲得黑脈羊肚菌抗氧化活性成分質(zhì)譜分析結(jié)果見表4。

圖6 1號(hào)峰質(zhì)譜全掃描分析Fig.6 Full mass spectrum analysis of No.1 chromatographic peak

圖7 2號(hào)峰質(zhì)譜全掃描分析Fig.7Full mass spectrum analysis of No.2 chromatographic peak

圖8 3號(hào)峰質(zhì)譜全掃描分析Fig.8 Full mass spectrum analysis of No.3 chromatographic peak

表4 黑脈羊肚菌中抗氧化活性成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)及化合物推斷Tab.4 UPLC-Q exactive data and identification of antioxidative ingredients in Morchella angusticeps

由圖6～圖8可知，峰1化合物的保留時(shí)間為1.85 min，其化合物正、負(fù)離子掃描模式下獲得的加合離子分子量測(cè)定值分別為 [M+H]+：183.086 24、[M-H]-：181.070 60；峰2化合物的保留時(shí)間為2.54 min，其化合物正、負(fù)離子掃描模式下獲得的加合離子分子量測(cè)定值分別為 [M+H]+：294.154 33、[M-H]-：292.140 29；峰3化合物的保留時(shí)間為3.11 min，其化合物正、負(fù)離子掃描模式下獲得的加合離子分子量測(cè)定值分別為 [M+Na]+：215.015 99、[M-H]-：191.018 65。

應(yīng)用Xcalibur 4.0計(jì)算其可能的化學(xué)組成（誤差小于5×10-6）并推測(cè)分子式，峰1、峰2、峰3的分子式分別為 C6H14O6、C12H23O7N、C6H14O6，應(yīng)用HighChem Mass Frontier 7.0庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道推斷其可能的結(jié)構(gòu)，推斷3個(gè)抗氧化活性成分分別為峰1：山梨醇（sorbitol）、峰2：未知化合物、峰3：檸檬酸 （citric acid）。

3 討論

目前，針對(duì)黑脈羊肚菌抗氧化活性成分研究報(bào)道多見對(duì)其多糖、多酚氧化酶研究[13-14]，且除本研究前期[11]應(yīng)用在線抗氧化分析黑脈羊肚菌抗氧化活性外，均為僅應(yīng)用傳統(tǒng)離線抗氧化分析測(cè)定方法分析其總提物的抗氧化能力。應(yīng)用HPLC-DPPH在線分析方法，對(duì)水提、50%乙醇提、95%乙醇提取物的抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)，篩選其抗氧化活性成分，并應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對(duì)篩選所得抗氧化活性成分進(jìn)行定性分析，以期建立在線HPLC-DAD-MS-DPPH快速篩選和定性黑脈羊肚菌中抗氧化活性成分的方法。

研究表明，黑脈羊肚菌水提物抗氧化活性最優(yōu)，獲得抗氧化成分3個(gè)，成分3的抗氧化活性較優(yōu)；50%乙醇提取物及95%乙醇提取物中各篩選獲得抗氧化活性成分1個(gè)，即水提取物中各抗氧化活性成分1，其抗氧化活性較優(yōu)；水提取物中篩選獲得抗氧化活性成分2的抗氧化成分活性均較弱；三氯甲烷提取物中未篩選獲得抗氧化成分。應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對(duì)獲得抗氧化成分進(jìn)行定性分析，3個(gè)抗氧化活性成分分別為：山梨醇、未知化合物、檸檬酸。天然山梨醇、檸檬酸在自然界中分布廣泛，二者均具有極好的抗氧化活性，易溶于水、醇，檸檬酸可直接作為食品的抗氧化劑應(yīng)用。

為保證篩選獲得抗氧化活性成分的正確指認(rèn)，本研究中于HPLC-DPPH在線檢測(cè)法及UPLC-Q Exactive高分辨質(zhì)譜定性分析過(guò)程采用統(tǒng)一品牌與型號(hào)色譜柱，并對(duì)HPLC轉(zhuǎn)換至UPLC方法進(jìn)行摸索確認(rèn)。但因本試驗(yàn)中DPPH自由基由中壓恒流泵泵入，其壓力控制能力遠(yuǎn)弱于二元泵，故造成B路徑中抗氧化活性化合物與DPPH反應(yīng)后色譜圖基線不穩(wěn)定，可能一定程度上會(huì)影響倒峰的識(shí)別，從而影響抗氧化活性物質(zhì)的篩選，后續(xù)研究中將對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)。

石芳等[15]應(yīng)用高分辨質(zhì)譜對(duì)黑脈羊肚菌多酚化合物進(jìn)行鑒定，共鑒定出15種多酚成分，多酚成分均具有不同程度的抗氧化活性，但與本研究中3種抗氧化活性成分結(jié)果并無(wú)重合，推測(cè)原因?yàn)榉宇惓煞州^不穩(wěn)定，易氧化，而本研究提取純化過(guò)程中存在加熱等步驟，造成其文中所述多酚類成分的不穩(wěn)定，故有上述結(jié)果。

黑脈羊肚菌抗氧化活性成分主要為水溶性小分子極性化合物，以水提取部位含量最為豐富。本試驗(yàn)中通過(guò)HPLC-DPPH在線檢測(cè)法，篩選黑脈羊肚菌不同提取部位的抗氧化活性成分，并應(yīng)用UPLCQ Exactive超高效液相色譜高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)篩選所獲得抗氧化成分進(jìn)行定性分析，獲知黑脈羊肚菌的抗氧化活性成分，建立了較為直觀、快速、準(zhǔn)確并適用于復(fù)雜天然產(chǎn)物中抗氧化活性成分快速篩選與定性的方法。