野生毛尖蘑菌株分子鑒定及碳源與氮源篩選試驗*

杜 萍，曹天旭，2**，崔寶凱

（1.長江師范學院現代農業與生物工程學院，重慶 408100；2.江西農業大學農學院，南昌 330045；3.北京林業大學微生物研究所，北京 100083）

毛尖蘑 [Lyophyllum fumosum(Pers.)P.D.Orton]，別名金子蘑、仙蘑菇，是一種極為罕見的野生珍稀食（藥） 用真菌。在分類學上屬擔子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 離褶傘科 （Tricholomataceae） 離褶傘屬（Lyophyllum）[1-3]。毛尖蘑主要分布于我國黑龍江、吉林、遼寧、河北、青海、甘肅、河南等地[4]。在黑龍江省主要分布在大、小興安嶺一帶。由于生長在金礦開采后的沙灘（毛尖）上，因此得名毛尖蘑。

毛尖蘑色澤黃嫩，營養豐富，菇柄脆嫩爽口，味道清香，尤其干制加工后香氣更加濃郁。其多糖具有抗腫瘤，保肝護肝，增強免疫力等作用[5]。中醫認為該菇具有補腎、利尿、治腰酸痛、滲濕、健脾、止瀉等功效[5]，是高血壓、心血管和肥胖癥患者的理想食品，市場開發前景廣闊。

毛尖蘑生長條件苛刻，野生資源已十分有限，因此，實現人工栽培迫在眉睫。目前為止，毛尖蘑的研究主要集中在菌種分離、菌絲發酵培養、人工馴化栽培和粗多糖的提取及其功效分析方面[5-10]。鄭稚鶯等[11]利用一定濃度的茶堿在變溫條件下誘導出了毛尖蘑子實體原基。目前，毛尖蘑因菌絲生長緩慢，導致出現制種成功率低、易污染、出菇遲、產量低等現象，使其仍不能商業化栽培，且其分類地位尚不清楚。

內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）是中度保守區域，種內保守性相對一致，而種間差異較為明顯，這使得ITS應用于真菌的分子鑒定及屬內種間或種內差異比較明顯的菌群之間的系統分析[12]。從黑龍江省大興安嶺漠河采集到毛尖蘑標本，經子實體組織分離獲得純菌株，對其進行了ITS序列鑒定和碳源、氮源的篩選試驗，旨在明確毛尖蘑的分類地位、篩選菌絲培養適宜的碳源、氮源，為毛尖蘑的人工馴化栽培和藥用價值開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試標本

供試標本于2013年8月采集于黑龍江省大興安嶺漠河，樣品編號為DP20130801。

1.2 子實體外觀形態觀察及菌種分離

1.2.1 子實體外觀形態觀察

觀察并描述子實體表面性狀、結構、顏色、質地，進行形態學特征初步鑒定。

1.2.2 菌種分離

采用子實體組織分離方法分離菌種，分離培養15 d后，挑取先端菌絲接種于PDA培養基中進行純化培養，于25℃恒溫培養箱中培養4周，置于4℃冰箱保存備用。

1.3 樣品rDNA的ITS區段PCR擴增、測序及比對分析

1.3.1 樣品基因組DNA提取與檢測

菌絲體培養、收集及DNA提取方法詳見文獻[13]。

1.3.2 樣品rDNA的ITS區段PCR擴增與測序

采 用 真 菌 通 用 引 物 ITS 5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；ITS 4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，由英駿生物技術有限公司（invitrogen） 合成。

PCR 擴增體系為：10×Buffer 5.0 μL，25 mmol·L-1MgCl24.0 μL，4 mmol·L-1dNTPs 3.0 μL，5 U·μL-1Taq DNA polymerase 0.5 μL，10 μmol·L-1引物各 2.0 μL，模板 DNA 2.0 μL，ddH2O 31.5 μL，反應總體積為 50.0 μL。

擴增條件為：94℃預變性1 min；94℃變性30 s，60℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，共 30個循環；最后于72℃補平8 min，終止溫度為4℃。

擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，產物和Marker上樣量均為5 μL，電泳結果于Bio-Rad凝膠成像系統成像。PCR產物送華大基因（北京）公司測序。

1.3.3 ITS序列比對和同源性分析

將測序獲得的序列通過NCBI數據庫進行Blast，分析同源性。當物種的rDNA ITS區序列與比對的序列同源性≥99%時為相同種；同源性在95%～99%為相同屬[14]。

1.4 最適碳源、氮源篩選試驗

1.4.1 最適碳源篩選

試驗碳源：麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖。

無碳基礎培養基：KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、蛋白胨2.0 g、瓊脂18.0 g，水1 L。

分別將等量（2%）的麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖、葡萄糖，加入到無碳基礎培養基中，對毛尖蘑母種培養的碳源進行單因素篩選試驗，各設4個重復。

1.4.2 最適氮源篩選

試驗氮源：牛肉膏、麥麩、硫酸銨、酵母膏、黃豆粉、蛋白胨。

無氮基礎培養基：葡萄糖20.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂18.0 g，水1 L。

分別將等量（0.2%）的牛肉膏、麥麩、硫酸銨、酵母膏、黃豆粉、蛋白胨，加入到無氮基礎培養基中，對毛尖蘑母種培養的氮源進行單因素篩選試驗，各設4個重復。

1.5 數據分析

菌絲日均生長速度差異顯著性采用SPSS 16.0軟件中Duncan式新復極差法進行分析。菌絲生長速度（V，mm·d-1）公式為：

式中：R表示菌落半徑（mm）；D表示菌絲生長天數 （d）。

2 結果與分析

2.1 子實體形態觀察

毛尖蘑叢生子實體如圖1所示。每叢分枝3枚～7枚不等，菌蓋直徑1 cm～7 cm，邊緣稍內卷，半球形、扁半球形至平展，初期灰褐色，成熟時淺黃褐色。表面近平滑，菌肉白色，細膩，肉厚。菌褶直生或稍延生，密，黃褐至暗褐色。菌柄長4.0 cm～9.0 cm，粗1.0 cm～1.2 cm，基部粗大，頂端稍細，形似錐把，實心、質脆，往往擠為一堆呈樹樁狀。

圖1 野生毛尖蘑子實體Fig.1 Fruiting bodies of the wild Lyophyllum fumosum

2.2 測序結果及其序列分析

本研究分離菌株的ITS序列已提交到GenBank數據庫，登錄號為MG571757，該菌株ITS區域核酸序列總長為677 bp。將樣品ITS序列輸入NCBI網頁，用Blast進行比對，結果有2株核酸序列與其有99%的相似度，因此，鑒定該株野生菌為Lyophyllum fumosum。經查閱資料得知學名為褐離褶傘，別名有白荷葉離褶傘[15]、煙色離褶傘、褐黃離褶傘、毛尖蘑、塊根蘑、賓王菇等[4]。

2.3 不同碳源對毛尖蘑菌絲生長的影響

菌絲在不同碳源培養基上的生長狀況見圖2、表1。

圖2 褐離褶傘菌絲在不同碳源培養基上的生長情況Fig.2 Mycelia growth situation of Lyophyllum fumosum on different carbon source media

由圖2可知，毛尖蘑菌絲在不同碳源培養基上均能生長，菌絲白色至米白色，氣生菌絲不發達。由表1可知，培養時間為28 d的菌絲在可溶性淀粉培養基上日均生長速度最快，菌絲濃密、粗壯，邊緣生長整齊。在P＜0.05水平上，與玉米粉培養基上的菌絲日均生長速度相比差異顯著，與麥芽糖、蔗糖、甘露醇、對照和葡萄糖培養基上的菌絲日均生長速度相比差異不顯著。而培養時間為35 d的菌絲，在不同碳源培養基中日均生長速度差異明顯，其中麥芽糖培養基上的菌絲日均生長速度最快，與以可溶性淀粉為碳源的菌絲日均生長速度相比差異不顯著，與其他5種碳源菌絲日均生長速度相比差異顯著；在無碳培養基上菌絲日均生長速度最慢，與除麥芽糖和可溶性淀粉外的其他4種碳源菌絲日均生長速度相比差異不顯著，可見，菌絲培養最后1周生長速度有減慢的趨勢。從2段培養時間綜合考慮，最終確定毛尖蘑菌絲培養的適宜碳源是可溶性淀粉和麥芽糖。

表1 不同碳源對褐離褶傘菌絲生長的影響Tab.1 Effect of different carbon sources on the mycelia growth of Lyophyllum fumosum

2.4 不同氮源對毛尖蘑菌絲生長的影響

菌絲在不同氮源培養基上的生長狀況見表2、圖3。

表2 不同氮源對褐離褶傘菌絲生長的影響Tab.2 Effect of different nitrogen sources on the mycelia growth of Lyophyllum fumosum

圖3 褐離褶傘菌絲在不同氮源培養基上的生長情況Fig.3 Mycelia growth situation of Lyophyllum fumosum on different nitrogen sources media

由圖3可知，毛尖蘑菌絲在不同氮源培養基上均能生長，除在無氮培養基中有1皿感染雜菌外，其余氮源的各處理均未發生感染，表明毛尖蘑菌株對不同氮源的適應性較強。由表2可知，在P＜0.05水平上，不同氮源培養的菌絲日均生長速度差異不明顯。其中以黃豆粉為氮源的菌絲日均生長速度最快，與牛肉膏培養基上的菌絲日均生長速度相比差異顯著，與其他5種氮源的日均生長速度相比差異不顯著，但其菌絲較稀疏，邊緣生長不齊；在無氮培養基（CK） 中的菌絲稀疏，生長不齊，長勢很弱。因此，從菌絲長勢和生長速度方面綜合考慮，最終確定蛋白胨、硫酸銨和酵母膏為毛尖蘑菌絲培養的適宜氮源。

3 討論

由于離褶傘屬真菌的各個種在形態上并無十分明確的區別[16]，因而僅通過形態上的觀察并不能確定其種名。本研究中，采集到的野生毛尖蘑菌株經ITS序列分析鑒定為褐離褶傘。

本文中，利用單因子試驗篩選出毛尖蘑菌絲生長的適宜碳源為可溶性淀粉和麥芽糖，其中培養時間為28 d的菌絲，在以蔗糖和葡萄糖為碳源的培養基上，與以可溶性淀粉和麥芽糖為碳源的菌絲日均生長速度相比差異不顯著（P＜0.05），但無論在長勢還是生長速度上都遜色于可溶性淀粉和麥芽糖。梁秀鳳等[8]對毛尖蘑一級菌種配方篩選試驗表明，蔗糖和麥芽糖可作為碳源交替使用，最佳氮源為酵母膏。鄭秋霞等[1]研究表明暗褐離褶傘菌絲生長的最適碳源是麥芽糖，最適氮源是蛋白胨。周會明等[17]對5株荷葉離褶傘的碳氮源篩選表明，有3個菌株的最適碳源是蔗糖，最適氮源是蛋白胨；另2個菌株的最適碳源是葡萄糖，最適氮源是蛋白胨。綜上所述，離褶傘屬不同種或同一種的不同菌株[8，17]對碳源的需求種類較豐富而敏感，對氮源的需求種類則相對單一而穩定，多為蛋白胨和酵母膏。因此，對于不同離褶傘菌株在培養前有必要做碳源適宜性篩選試驗。

4 結論

本研究中采集到的野生毛尖蘑菌株經ITS序列分析鑒定為褐離褶傘。利用單因子試驗篩選出毛尖蘑菌絲生長適宜的碳源為可溶性淀粉和麥芽糖，適宜氮源為蛋白胨、硫酸銨和酵母膏。最佳培養基配方為：可溶性淀粉（麥芽糖） 20 g、蛋白胨（硫酸銨、酵母膏） 2 g、KH2PO41.0 g、MgSO40.5 g、瓊脂18 g，水 1 L。