大腸桿菌 O157溶源性噬菌體的誘導及鑒定

李 雷，于 婧

(吉林大學第一醫院 第一手術室,吉林 長春130021)

致病性大腸桿菌O157是重要的食源性致病微生物，O157:H7是腸出血性大腸桿菌常見的血清型,是以食物為主要傳播途徑的致病菌,牛、羊、豬和雞等家畜家禽是其主要宿主[1，2]，該菌致病性強、致死率高，引起全世界廣泛重視[3]。溶源性作為溫和噬菌體與宿主共存的一種現象廣泛存在于自然界中。目前，物理或化學的方法是誘導溶源狀態的噬菌體進入裂解周期的重要手段。國內外學者曾利用絲裂霉素C(MMC)誘導溶源性嗜鹽古生菌及溶源性單增李斯特菌產生噬菌體[4，5]，但對溶源性大腸桿菌 O157誘導的具體方法探討較少，本研究利用絲裂霉素C作為溶源狀態噬菌體的誘導劑,設定不同的濃度梯度和時間梯度，具體討論從大腸桿菌 O157中誘導產生噬菌體的條件及方法,并對誘導后的噬菌體基因組進行初步鑒定，為今后從溶源性大腸桿菌O157中誘導噬菌體提供方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料13株大腸桿菌 O157(YJ01、YJ02、YJ03、YJ04、YJ05、YJ06、YJ07、YJ08、YJ09、YJ10、YJ11、YJ12、YJ13)分離自長春地區養牛場，并經VITEK-32全自動微生物分析鑒定系統分析鑒定。

1.2 溶源性噬菌體誘導[6]①從平板上挑取大腸桿菌O157單菌落,接種于LB液管中,37℃培養過夜。②將活化的菌種以5%的接種量接入LB培養基中,37℃培養至對數生長期。③添加絲裂霉素C,使其終濃度達到0.5 μg/ml,靜置培養16 h,4 000×g離心30 min，上清用0.22 μm濾膜過濾，4℃保存備用。

1.3 噬菌體制備及電鏡觀察遵循噬菌體顆粒提取的經典方法，制備噬菌體顆粒，參照Lu Z等的文獻[7]。在復膜銅網上滴15 μl左右噬菌體顆粒懸液，等待15 min，用1滴2%磷鎢酸染色，待銅網干燥后，于電壓80 kv的條件下，采用Hitachi透射電鏡觀察并拍照[8]。

1.4 噬菌體核酸的提取及酶切分析噬菌體全基因組的提取依照噬菌體基因組DNA提取的傳統方法進行[9]。提取的噬菌體全基因組首先經瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸提取質量及其純度，然后分別用 DNA酶I、綠豆核酸酶、RNA酶A三種酶對噬菌體基因組進行消化，最終再次通過瓊脂糖凝膠電泳實驗對結果進行檢測，從而初步鑒定噬菌體核酸類型。

2 結果

2.1 噬菌斑形態觀察誘導結果用瓊脂雙層鋪板檢驗，結果顯示，未經過絲裂霉素C誘導的O157觀察不到噬菌斑，整塊平皿模糊、不透明，表明沒有噬菌體釋放。用絲裂霉素C 誘導后的細菌培養物的濾液，在濾液未作稀釋時，可以看到大量的噬菌斑連成一片。濾液稀釋10-1和10-2培養10-12 h，可以觀察到單個噬菌斑，噬菌斑較小，且噬菌斑周圍有不透明暈圈，噬菌斑直徑在0.6-0.8 mm(圖1)。

2.2 電鏡觀察將噬菌體粗制顆粒經負染，電鏡觀察并拍攝，電鏡觀察結果顯示，該噬菌體頭部直徑約80 nm、尾長約180 nm(圖2)，將其命名為DM001，從而證實噬菌體誘導成功。根據ICTV的最新分類標準，噬菌體DM001隸屬于有尾噬菌體目肌尾病毒科[10，11]。

2.3 酶切分析提取的噬菌體基因組瓊脂糖凝膠電泳顯示只有一條清晰的條帶(圖3)，說明在此條件下僅誘導出1種噬菌體，且該噬菌體所提取的核酸沒有宿主菌O157基因組的污染。RNAseA及綠豆核酸酶對該噬菌體基因組均不產生影響，電泳結果顯示噬菌體基因組仍然完整并未降解，但核酸酶DNaseI組噬菌體基因組完全被降解，電泳結果并未出現條帶，由此可以斷定，DM001基因組為雙鏈DNA。經BandScan軟件分析，DM001大小約為30 Kb。

3 討論

國內外大量的研究及生物信息學分析結果顯示，在各類微生物基因組中都廣泛存在著溶源噬菌體或其基因組片段。但由于敏感菌株篩選較難得到，這些溶源噬菌體的存在經常在研究中被人們忽視[12]。溶源狀態是一種十分穩定的存在狀態，在宿主菌中可持續存在多代。但在某些條件如紫外線、致癌劑、突變劑、X線等作用下，可打破其原有的溶源周期，使噬菌體進入溶菌性周期，這種現象稱為前噬菌體的誘導與切離(excision)，發生率約為10-2-10-5[13]。但仍存在另一種奇特現象，有少數溶源性細菌中的前噬菌體，它們在利用細菌的系統合成自身的基因組后，并不立刻組裝成成熟噬菌體對宿主菌進行攻擊，這個現象即稱為"治愈"。溶源性細菌是一種較頑強存在，相比于同種細菌，它對同種或有親緣關系較近的噬菌體的抵抗力更強，從而使宿主菌獲得某種噬菌體免疫性[14]。

圖1 噬菌斑形態 圖2 噬菌體DM001電鏡圖像圖3 噬菌體基因組的核酸酶消化結果

本實驗首先利用絲裂酶素C 進行溶源性噬菌體的誘導，從13株大腸桿菌O157菌株中誘導獲得一株溶源性噬菌體，命名為DM001，誘導比例為7.69%，顯示出較高的誘導率。然后透射電鏡觀察證實噬菌體誘導成功，證實獲得1株溶源性噬菌體。結果表明，用絲裂霉素誘導溶源性噬菌體進入裂解周期是可行的，并且成功率較高。經分析得出，在絲裂霉素C的終濃度為1 μg/ml，經15 h誘導，進入裂解周期的噬菌體最多，噬菌斑數量肉眼可見量最大，故為誘導的最佳條件。最后利用綠豆核酸酶、RNAseA和 DNaseI分別對噬菌體基因組進行消化，瓊脂糖凝膠電泳確定其核酸類型為雙鏈DNA，經BandScan軟件分析，得出初步結果，噬菌體DM001基因組大小約為30 Kb，確定噬菌體為一株雙鏈DNA的細菌病毒，提取DNA后已進行測序，以便下一步在基因水平上進行深入討論。