乙酰紫草素誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡的實驗研究

何茂旭，韓麗麗，王 佩，付 莉*，裴 越，劉盈盈，孫森森

(1.吉林大學第二醫院 婦產科，吉林 長春130041；2.青島市中心醫院 婦產科，山東 青島266042)

卵巢癌是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一,其病死率居婦科惡性腫瘤首位，患者5年生存率低于30%[1]。目前卵巢癌的治療主要以手術為主、放化療為輔綜合治療，但對于手術不能完全切除晚期患者，化療成為卵巢癌綜合治療的重要組成部分。然而化療藥耐藥性已成為卵巢癌治療的重要問題之一[2]。乙酰紫草素是一種天然的紅色色素，存在于我國傳統常見中藥—紫草的根中，具有抗炎和抗腫瘤活性[3]。乙酰紫草素對多種腫瘤細胞如結腸癌、胰腺癌及乳腺癌等具有一定的抑制作用[4-6]。本實驗主要探討乙酰紫草素是否能誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Multiskan FC型酶標儀(美國Thermo公司)，BD FACSVia型流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)，Ti-E型熒光顯微鏡(日本Nikon公司)。

試劑：乙酰紫草素(純度98%，上海純優生物)，青霉素，鏈霉素，胰蛋白酶，MTT，1640培養液(Hyclone,US) ，胎牛血清(天津灝洋生物)，Annexin V/FITC及PI雙染試劑盒(Sigma，US)。

細胞：卵巢癌SKOV3細胞株(中國科學院上海細胞生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1MTT法檢測SKOV3細胞的抑制率 將對數生長的卵巢癌SKOV3細胞懸液,以5×105個/mL密度接種在96孔板,每孔100 μl,每組設5個復孔。標準條件下培養過夜,于48小時加入含新的乙酰紫草素的培養液,乙酰紫草素每孔終濃度分別為1，5，10，20，30，40，50，60，70,80,90 μmol/L，對照組不加乙酰紫草素(只含等量培養基),各組細胞均培養48小時后加入10 μl MTT溶液(5 mg/mL)處理,加入100 μl DMSO,避光振蕩10 min,并通過酶標儀在490 nm波長下檢測每個孔的吸光度值(A),每組濃度重復檢測3遍,計算平均值,然后計算乙酰紫草素對SKOV3細胞的抑制率。抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.2流式細胞儀檢測細胞凋亡率 乙酰紫草素處理卵巢癌SKOV3細胞，PBS洗滌兩次并重懸于結合緩沖液中,然后加入5 μl Annexin V-FITC。此外，加入5μL PI,將細胞在室溫黑暗中孵育10 min,并通過流式細胞術測量凋亡率。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 乙酰紫草素對卵巢癌細胞系SKOV3的抑制作用

本研究中不同濃度的乙酰紫草素對SKOV3細胞均有不同程度的抑制作用，當乙酰紫草素濃度低于40 μmol/L時，隨著乙酰紫草素濃度增加，對細胞的抑制率顯著增加，4種濃度(1、5、10、20 μmol/L)之間的抑制率有統計學差異，P<0.05。當乙酰紫草素濃度大于40 μmol/L后，抑制率不再明顯增加，進入平臺期。根據計算IC50為10.85 μmol/L(見圖1)。

2.2 應用乙酰紫草素后SKOV3細胞周期和凋亡率的變化

本實驗選用乙酰紫草素IC50濃度(10.85 μmol/L)作用于卵巢癌SKOV3細胞，48小時后測量SKOV3細胞的凋亡率和細胞周期，結果見表2。

圖1 不同濃度乙酰紫草素對SKOV3細胞作用的量效曲線

3 討論

乙酰紫草素做為中國傳統中藥—紫草的主要成分，其藥理作用十分廣泛，現代藥學研究證明抗腫瘤作用是其主要作用之一[7]。已有研究證實乙酰紫草素能抑制多種腫瘤細胞增殖[8]。通過本實驗，我們發現乙酰紫草素也能抑制卵巢癌SKOV3細胞的生長，但具體機制尚不清楚。有研究發現，在肺癌細胞中，乙酰紫草素可以誘導孤兒受體Nur77的表達和線粒體定位，從而誘導其發生凋亡。Liu[9]等人還發現乙酰紫草素可以通過TR3/Bcl-2途徑誘導Nur77線粒體轉運并誘導細胞凋亡,從而發揮抗腫瘤的作用。因此，我們猜想，乙酰紫草素抑制卵巢癌SKOV3細胞生長的機制可能也與其誘導Nur77線粒體定位有關。并且已有相關文獻報道[10]在腫瘤細胞中,Nur77可能改變Bcl-2的表型作用于線粒體,最終導致細胞凋亡。由此也進一步為我們的猜想提供了一定的理論依據。

表2 乙酰紫草素作用后SKOV3細胞周期和凋亡率的變化

雖然我們通過這個實驗發現乙酰紫草素可以誘導卵巢癌SKOV3細胞凋亡，但是，其作用機制尚不清楚，仍需要進行更多的實驗研究來進行探索。進一步明確其抑制作用機制可能為開發新的抗卵巢癌藥物提供新的思路，亦可能開發出抗腫瘤藥物的新靶點。