HDAC抑制劑通過miR-200c調控靶向CRKL抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲的研究

譚 潔，李婧婷，邊學海

(吉林大學中日聯誼醫院 甲狀腺外科·吉林省外科轉化醫學重點實驗室，吉林 長春130033)

組蛋白的乙酰化修飾離不開組蛋白去乙酰化酶(HDACs)，HDACs可影響多種癌基因或抑癌因子的表達，導致細胞的惡性增殖和腫瘤的發生[1]。HDAC抑制劑在體外實驗中已證實可抑制乳腺癌細胞增殖，侵襲和遷移[2]，然而HDAC抑制劑在乳腺癌中的抗癌機制以及調控信號等方面知之甚少。miRNAs是19-25個核苷酸的非編碼RNA，在乳腺癌中異常表達，并為腫瘤行為和進展起調節作用[3]。據報道miR-200c可作為潛在腫瘤抑制因子，調節乳腺癌腫瘤血管生成、增殖、侵襲和遷移[4]。最近報道HDAC抑制劑與miR-200家族成員之間有直接關系[2]。據報道，銜接蛋白(CRKL)在人乳腺癌中過度表達，它作為腫瘤發生的啟動因子可能在乳腺癌的腫瘤增殖和遷移中起重要作用[5]，可能成為潛在的新型診斷標志物和治療靶點。本研究探討HDAC-miR200c-CRKL信號軸在乳腺癌細胞調節中意義，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 細胞株、細胞轉染及HDAC抑制劑處理

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231，HCC-1143，HCC-1395，MCF-7，SKBR3，HCC-1419和MDA-MB-361，及兩種正常的乳腺上皮細胞株MCF-10A和A1N4均購自美國典型培養物保藏中心，細胞維持在含10%胎牛血清的RPMI-1640中。 MCF-7需在培養基中加入5 mg/mL胰島素生長。 MCF-10A和A1N4細胞在含0.5%胎牛血清、0.5 mg/mL氫化可的松、5 mg/mL胰島素和10 ng/mL表皮生長因子的IMEM中培養。 所有細胞在5%CO2、37℃培養箱中生長并保持，每3-4 d傳代一次，取對數生長期的細胞進行實驗。

hsa-miR-200c-3p模擬物(目錄號4464066)，hsa-miR-200c-3p抑制劑(目錄號4464084)和CRKL siRNA(目錄號4392420)購自美國ThermoFisher公司，通過Lipofectamine 2000進行細胞轉染。HDAC抑制劑Vorinostat(SAHA)購自美國Shelleckchem公司，用1 μM SAHA處理MDA-MB-231乳腺癌細胞24小時。

1.2 定量RT-PCR分析

用Trizol法從細胞提取總RNA。U6和β-Actin分別作為miR-200c和CRKL、HDAC1-11擴增的內參。用紫外分光光度計進行定量，測量D260 nm/D280 nm比值定量PCR分析。PCR擴增條件：95℃10分鐘，緊接95℃20秒和60℃30秒，36個循環。由PCR儀自帶軟件自動完成擴增過程及數據分析。

1.3 Western-blotting印跡分析

使用RIPA緩沖液提取處理細胞的總蛋白質。加載蛋白質并在10%SDS-PAGE凝膠上分離，然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉以1∶10 000稀釋度將膜在4℃與抗CRKL的單克隆抗體溫育過夜。用TBST洗滌后，膜與1∶20 000稀釋度的抗小鼠IgG孵育1小時，按DAB顯色試劑盒說明進行DAB顯色。用凝膠圖像分析系統掃描，進行吸光度分析，計算與其對應的內參條帶的比值表示蛋白質水平。使用ImageJ軟件測量蛋白質條帶定量。

1.4 細胞增殖測定

通過MTT法測定MDA-MB-231細胞的活力和增殖。將以1×104個細胞接種于96孔培養板，每孔培養液總量100 μl，并留用SAHA處理。孵育24、48、72、96 h后，每孔加入20 μl的MTT，并在37℃下再溫育2 h，在酶譜儀測量490 nm處吸光度值。

1.5 基質膠侵襲實驗

為反映細胞浸潤能力，在用miR-200c模擬物轉染或用SAHA處理后，將5×104/孔細胞接種于適配于24孔培養板的BioCoat Matrige培養小室中。 使上室細胞在37℃、5%CO2孵育箱中過夜。棉簽擦去上室內未侵入的細胞。侵入細胞用100%乙醇固定15分鐘，蘇木精-伊紅染色，40倍放大光學顯微鏡下隨機拍攝10個視野并進行細胞計數，取平均值。

1.6 劃痕實驗

為反映細胞遷移能力，將轉染的細胞接種在6孔板中，當細胞數量達到80%時，去除上清液并用無菌200 μl移液槍頭沿板中線劃痕，用PBS清洗碎片。使用倒置顯微鏡在不同時間點獲得連續照片。測量并記錄刮痕兩側細胞前端之間的距離。

1.7 統計分析

每個實驗重復三次。應用SPSS 19.0統計軟件，各組之間的統計學差異使用t檢驗或χ2檢驗進行分析。P<0.05為有差異；P<0.01為顯著性差異，具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-200c在乳腺癌細胞中呈低表達，與HDAC IIa成員的表達水平反比

與正常乳腺上皮細胞株相比，miR-200c在乳腺癌細胞株中均呈低表達；在三陰性乳腺癌細胞株MDA-MB-231，HCC-1143和HCC-1395中顯著低表達(圖1 A)。相反，HDAC2和IIa類HDAC包括HDAC9，HDAC4，HDAC5和HDAC7在乳腺癌細胞株中呈高表達(圖1 B)；尤其HDAC9在所有乳腺癌細胞株中均顯著高表達。結果顯示，miR-200c與HDAC2和IIa類HDACs的表達水平呈負相關。

2.2 過表達miR-200c可抑制乳腺癌細胞的增殖，侵襲和遷移

將miR-200c模擬物轉染到MDA-MB-231中以過表達miR-200c(圖2A)。過表達miR-200c顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖和生長(圖2A)?；|膠侵襲實驗結果表明，過表達miR-200c轉染的MDA-MB-231細胞的侵襲性顯著降低(圖2B)。劃痕實驗結果表明，miR-200c的過表達抑制了細胞的遷移(圖2C)。結果支持miR-200c對乳腺癌增殖，侵襲和遷移起重要的抑制作用。

圖1 (A) miR-200c在乳腺癌細胞中呈低表達。(B) HDAC9，HDAC4，HDAC5和HDAC7在乳腺癌細胞株中呈高表達，尤其HDAC9在所有乳腺癌細胞株中均顯著高表達

圖2 (A) miR-200c模擬物轉染乳腺癌MDA-MB-231細胞與非轉染細胞，24,48,72或96 h增殖分析，與對照相比，*P<0.05和**P<0.01。 (B) 100 nM miR-200c轉染MDA-MB-231細胞與非轉染細胞，基質膠侵襲16 h后對比。(C) 100 nM miR-200c轉染MDA-MB-231細胞與非轉染細胞，劃痕實驗24 h、48 h后對比。

2.3 miR-200c直接靶向CRKL作用

CRKL在乳腺癌細胞株中均呈高表達，表明在乳腺癌細胞中，miR-200c水平與CRKL呈反相一致。為了鑒定miR-200c靶基因，利用生物信息學分析掃描了基因組中推定miR-200結合位點，并將CRKL鑒定為miR-200的預測靶基因。用miR-200c模擬物轉染MDA-MB-231細胞后，Western blotting分析CRKL的蛋白表達，顯示過表達miR-200c使CRKL表達下調了約68%(圖3)。

2.4 HDAC抑制劑通過調節miR-200c和CRKL抑制乳腺癌細胞的增殖和侵襲

為了證實miR-200c是HDAC抑制劑的抗癌機制的功能性介質，將SAHA作為本研究的典型HDAC抑制劑。先用miR-200c抑制劑轉染MDA-MB-231細胞，再用SAHA處理，結果顯示，SAHA處理后miR-200c表達上升(圖4A)，相反CRKL表達下降(圖4B)；顯著降低乳腺癌細胞的增殖并阻止其侵襲。通過用100 nM miR-200c抑制劑轉染下調miR-200c可部分削弱SAHA對乳腺癌細胞增殖和侵襲的抑制。

圖3 分別用100 nM miR-200c抑制劑或1 nM,10 nM和100 nM miR-200c模擬物的對MDA-MB-231細胞處理24小時。通過蛋白質印跡試驗，異位miR-200c表達的乳腺癌細胞的CRKL表達水平。 β-Actin用做對照。與對照相比，*P<0.05和**P<0.01。

圖4 (A)用1 μM SAHA單獨處理或SAHA及100 nM miR-200C抑制劑聯合處理MDA-MB-231細胞24 h，然后RT-PCR定量分析miR-200c表達水平，與對照相比，*P<0.05和**P<0.01。 (B)用1 μM SAHA，100 nM miR-200c，100 nM CRKL siRNA單獨處理或SAHA及 miR-200c抑制劑的聯合處理MDA-MB-231細胞24 h，然后Western印跡分析CRKL表達水平，與對照相比，*P<0.01

3 討論

乳腺癌是女性惡性腫瘤死亡的主要原因之一[6]。與乳腺癌發生、發展相關的表觀遺傳學改變成為近年研究熱點。HDAC抑制劑在乳腺癌中的抗癌機制目前尚不清楚。本研究結果表明HDAC抑制劑部分通過miR-200c下調CRKL表達，發揮抑制乳腺癌細胞發展、侵襲等的作用，為HDAC抑制劑治療乳腺癌機制提供了新證據。

miR200家族成員作為潛在抑制因子與乳腺癌的生長，遷移和侵襲相關[7]。我們的研究顯示miR-200c在乳腺癌細胞中呈現低表達；在用miR-200c模擬物轉染乳腺癌細胞后，明顯抑制了腫瘤細胞增殖，侵襲和遷移；相反，抑制miR-200c表達時，可促進細胞增殖和遷移。因此，這些結果表明miR-200c抑制乳腺癌的發生、發展。

本項研究證實：乳腺癌細胞中，miR-200c的直接靶標是CRKL。提高外源性miR-200c表達可顯著降低CRKL蛋白水平。在用miR-200c抑制劑轉染MDA-MB-231乳腺癌細胞，抑制miR-200c表達后，呈現CRKL蛋白表達上調。因此，miR -200c表達水平與CRKL蛋白水平呈負相關。CRKL作為致癌基因在許多惡性腫瘤中呈過度表達。CRKL過度表達在乳腺癌細胞的遷移和侵襲中發揮作用，并與不良預后顯著相關[8]。研究結果首次確定CRKL蛋白水平與miR-200c表達之間呈顯著負相關性，這為乳腺癌提供一種新的診斷標記和潛在的治療靶點。

我們的數據顯示在HDAC抑制劑處理后，乳腺癌細胞中miR-200c的表達水平顯著上調，而CRKL表達在mRNA和蛋白質水平均下調。已有研究表明，HDAC抑制劑可以激活基因表達，抑制腫瘤細胞的生長和存活，HDAC抑制劑可作為潛在治療癌癥的新藥。Vorinostat是美國FDA批準用于治療皮膚T細胞淋巴瘤的第一個HDAC抑制劑[9]。HDAC抑制劑已證實能誘導p21Waf1/Cip1 mRNA的表達而抑制腫瘤的增殖[10]。最近研究，HDAC抑制劑SAHA可通過誘導上皮-間質轉化(EMT)抑制乳腺癌細胞的遷移[11]。而HDAC抑制劑在乳腺癌中下游抗癌機制以及信號傳導是否涉及其他表觀遺傳變化仍然不清楚。本研究結果證實miR-200c表達降低削弱了HDAC抑制劑在乳腺癌細胞中的抑制功能，表明miR-200c與HDAC抑制劑在抗乳腺癌過程中的相互作用。此外，miR-200c通過下調CRKL表達而抑制細胞增殖，遷移和侵襲。研究中，當乳腺癌細胞轉染miR-200c抑制劑時，不完全阻斷SAHA抑制細胞增殖和侵襲的作用。我們認為HDAC抑制劑SAHA抗癌作用至少部分通過miR-200c-CRKL軸來實現。

總之，本項研究表明miR-200c是通過下調CRKL水平來抑制乳腺癌的增殖，侵襲和遷移的。明確HDAC抑制劑的抗癌作用部分是通過調節miR-200c直接靶向CRKL來實現的。因此，HDAC-miR200c-CRKL信號軸可能在HDAC抑制劑抗乳腺癌機制中起重要作用。本研究揭示了HDAC抑制劑臨床治療乳腺癌的理論，并提示HDAC-miR200c-CRKL信號軸可能成為乳腺癌新的診斷標志物和潛在的治療靶點。