山楂葉總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織Caspase-3表達的影響

曲若寧，李麗靜，吳曉光

(1.吉林大學中日聯誼醫院 藥學部，吉林 長春130033;2.承德醫學院附屬醫院 藥學部;3.河北省中藥開發與研究重點實驗室)

腦缺血再灌注損傷是多種機制參與的復雜病理過程，而腦組織持續性缺血缺氧誘發神經元凋亡，為梗死灶擴大和遲發型神經元損傷的主要機制[1，2]，凋亡決定了最終梗死體積[3]。因此，研制抑制細胞凋亡的藥物，可有效減輕缺血性腦損傷的程度[4]。山楂葉總黃酮(TFHL)是中藥山楂葉中黃酮類化合物的總稱，具有抗自由基、抑制炎癥反應過程等藥理作用，目前臨床廣泛應用于心血管疾病[5]。本研究以線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型，觀察TFHL對腦缺血再灌注損傷的作用及其對凋亡相關蛋白Caspase-3表達的影響，旨在從細胞凋亡角度探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級雄性SD大鼠90只，(8-9)月齡，體質量230-250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證書：scxk(京)2006-2009。

1.2 動物模型建立參照Longa[6]法并加以改進，采用線栓法建立左側大腦中動脈栓塞局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型。線栓采用0.235 mm釣魚線，自頸外動脈插入頸內動脈直至大腦中動脈起始部，插入深度距頸動脈分叉約18.5±1 mm，2 h后拔除線栓實現再灌注。假手術組5只，除不插入線栓外其他操作同模型組。大鼠清醒后，參照Bederson[7]等方法，對MCAO大鼠進行神經功能評分：0分，無任何神經損傷癥狀；1分，提尾時右前肢屈曲；2分，爬行時向右側轉圈；3分，自發運動時向右側轉圈，成追尾狀或向右側傾斜；4分，不能自然行走或意識完全喪失。選取1-3分者入實驗，選出有效模型75只，隨機分為模型組、TFHL低、中、高劑量組和陽性對照組，每組15只。

1.3 給藥劑量與方法以TFHL為治療藥物，銀杏葉片為陽性對照藥物，灌胃給藥，連續36 d。TFHL低、中、高劑量組給藥劑量為70、140、280 mg·kg-1·d-1，銀杏葉片給藥劑量為24 mg·kg-1·d-1。假手術組和模型組給予等量的生理鹽水。

1.4 檢測指標

1.4.1TTC染色 末次給藥后1 h，每組隨機取6只，斷頭取腦，-20℃冰箱凍存3 min，蠟板上行冠狀切片，片厚2 mm，共切5片。將腦片置于2%TTC中染色，37℃恒溫孵育60 min。數碼相機拍照，應用MiVnt病理圖形分析系統測量腦梗死面積和全腦面積并計算腦梗死體積占大腦總體積的百分比。

1.4.2電鏡觀察海馬CA1區神經元超微結構的改變 末次給藥后1 h，每組隨機取3只，30mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合液左心室插管灌注固定后，體式顯微鏡下選取缺血邊緣區1 mm3大小腦皮質，3.5%戊二醛后固定，用于超微結構觀察。

1.4.3腦組織切片病理學檢查 末次給藥后1 h，每組隨機取6只，30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定后，斷頭取腦，在蠟板上選取腦組織視交叉至大腦橫裂冠狀腦組織，依次脫水、透明、浸蠟及包埋，Leica石蠟切片機連續冠狀切片，片厚5 μm，4℃冰箱保存,備用。常規HE染色、封片，光鏡下觀察并拍照。

1.4.4免疫組化檢測 兔抗Caspase-3單克隆抗體購于美國santa公司，SP免疫組化試劑盒購于北京中衫金橋生物技術有限公司，DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。取上述4℃冰箱保存備用的大腦切片，常規脫蠟脫水，按試劑盒說明書操作步驟操作，DAB顯色，光鏡下Caspase-3陽性染色呈棕黃色。陰性對照片用PBS代替一抗，其余操作相同。拍照，再Mivnt顯微圖像分析系統下進行半定量分析。對采集圖片中的棕黃色顆粒進行密度掃描，測平均灰度值。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 山楂葉總黃酮對MCAO大鼠腦梗死體積的影響

假手術組大鼠腦片呈均勻的紅色，未見梗死灶，其他各組缺血側皮質、紋狀體、蒼白球部分區域呈現不同程度的梗死區(圖1)。但與模型組比較，TFHL各組腦梗死體積明顯減少(表1)。

a:假手術組；b:模型組;c:L-TFHL;d:M-TFHL;e:H-TFHL;f:銀杏葉片

圖1 MCAO大鼠缺血區腦梗死體積(TTC 染色 )

2.2 山楂葉總黃酮對海馬CA1區神經元超微結構的影響

電鏡顯示假手術組海馬CA1區神經元染色質均勻，各種細胞器如線粒體、高爾基體、內質網、溶酶體等結構界限清晰；模型組神經元腫脹，各種膜結構溶解、斷裂、不連續，染色質凝集、邊集，線粒體或出現嵴斷裂、空泡化或致密，嵴分辨不清，其它細胞器明顯減少；TFHL各組神經元超微結構損傷減輕(圖2)。

2.3 山楂葉總黃酮對MACO大鼠海馬CA1區神經元形態、密度的影響

由圖3可見，假手術組海馬CA1區神經元排列整齊緊密，可見3-4層細胞，染色均勻，結構完整，細胞核大而圓，核仁清晰；模型組大部分神經元變性壞死，正常神經元數量明顯減少，排列紊亂，細胞周圍間隙加大，細胞核濃縮、深染、溶解或消失，胞質結構不清；TFHL各組神經元損傷明顯減輕，正常神經元數量明顯增多，排列稍規則，但仍可見部分神經元變性，核仁不清，核固縮或消失。

模型組的正常神經元密度(ND)計數明顯降低，與假手術組比較，具有極顯著差異(P<0.01)，提示缺血再灌注造成了海馬CA1區神經元丟失；與模型組比較，TFHL各組神經元密度有所升高，且呈劑量依賴性(表2)。

2.4 山楂葉總黃酮對MCAO大鼠缺血區Caspase-3表達的影響

免疫組化法檢測Caspase-3陽性染色光鏡下呈棕黃色，陽性區域在神經元細胞核及細胞質。假手術組海馬神經元中僅少量表達，棕黃色染色較淺；模型組海馬神經元胞核出現大量棕黃色顆粒，染色較深，為強陽性；TFHL70、140和280 mg·kg-1·d-1組36d Caspase-3蛋白陽性表達細胞數量明顯減少。見圖4。

a:假手術組；b:模型組;c:L-TFHL組;d:M-TFHL組;e:H-TFHL組;f:銀杏葉片

圖3 TFHL對MCAO大鼠海馬CA1區神經元形態的影響(HE染色400×)

注：與假手術組比較：*P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

山楂葉總黃酮對Caspase-3 平均光密度比值的影響。與假手術組比較，模型組大鼠海馬Caspase-3 蛋白表達的光密度比值顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，TFHL70、140和280 mg·kg-1·d-1三組36 d光密度比值分別降低，說明TFHL能顯著抑制海馬CA1區神經元Caspase-3蛋白的表達。見表2。

3 討論

海馬和皮層是公認的缺血易損區，而海馬CA1區又是海馬各段缺血損傷最敏感的區域，故本研究的主要觀察對象為海馬CA1區神經細胞和皮層。結果表明，TFHL能明顯減少MCAO大鼠腦梗死體積，減輕海馬CA1區神經元損傷，證明TFHL對大鼠腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用，這與其他學者研究結果相一致[8]。另外，本研究發現TFHL對腦缺血再灌注損傷的改善作用與劑量呈正相關，劑量越大，這種改善作用越明顯，且TFHL280 mg·kg-1·d-1組36 d在減少腦梗死體積，減輕神經元損傷和抑制caspase-3等方面與銀杏葉片24 mg·kg-1·d-1組36 d比較無顯著差異性，這為TFHL藥用開發提供了新的依據，雖然達到同樣治療效果的前提下，TFHL用量要大得多，但TFHL資源豐富，彌補了銀杏葉資源不足的現狀。

a:假手術組；b:模型組;c:L-TFHL;d:M-TFHL;e:H-TFHL;f:銀杏片

Caspase-3是細胞凋亡級聯信號通路下游關鍵的執行蛋白酶[9，10]，在神經發育乃至腦缺血等神經系統疾病的病理生理過程中發揮著重要作用[11],腦缺血性損傷可激活Caspase-3蛋白，啟動細胞凋亡[12]，藥物干預可抑制細胞凋亡[13]。本研究結果顯示，TFHL各組Caspase-3表達較模型組顯著減少，凋亡神經元數量減少。腦缺血再灌注模型組核膜溶解或斷裂、染色質濃集，線粒體嵴斷裂、空泡化嵴分辨不清，符合細胞凋亡過程中重要的細胞形態學改特征[14]，提示TFHL可能通過抑制Caspase-3介導的細胞凋亡途徑達到對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用。本研究從細胞凋亡角度探討了山楂葉總黃酮和腦缺血再灌注損傷的關系，研究結果為研究防治缺血性腦血管病藥物提供了依據。