血漿miR-92a和miR-126水平變化在冠心病中的應用價值

劉玉薇，馮曉敏，萬 楠

(北部戰區總醫院 檢驗醫學中心，遼寧 沈陽110016)

近年來，心血管疾病的發生率不斷上升，已成為威脅人類健康的主要疾病，盡管現在可以進行有效的再灌注以及藥物治療，但每年全球仍有1700萬人死于心血管疾病[1]。MicroRNA(miRNA)在真核生物中固有的長度為21-25個核苷酸，是一類內源性非編碼小分子單鏈RNA，特異性識別靶基因mRNA的3′非編碼區，在轉錄后水平調控基因表達[2]。miRNAs調控生長發育并且參與許多病理生理過程，包括心血管疾病。有研究表明，在不同心血管疾病中，患者血漿miRNA含量不同，包括冠心病、心力衰竭、心肌炎、糖尿病等。重要的是，由于特定的miRNAs在心臟的各種細胞類型中差異性地富集，因此提示特定的miRNA的水平改變可能反映不同的心血管病理狀態[3]。miRNA以無細胞形式存在于人體循環中，可以在外周血中檢測到，并且在血漿和其他體液中發現了保護miRNA免受內源性RNA酶活性降解的穩定分子，這表明循環miRNA可能是心血管疾病中理想的生物標志物[4,5]。miR-126和miR-92a廣泛存在于內皮細胞(EC)和內皮祖細胞(EPC)，被認為是生理血管生成的主要調節劑。而內皮功能障礙促進了冠脈粥樣硬化的發生。因此，我們在本文中研究了血漿miR-126和miR-92a水平與冠心病的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年10月至2017年12月就診于沈陽軍區總醫院的胸痛患者93例，其中非冠心病(non-CAD)組20例，心絞痛(AP)組24例，急性心肌梗死(AMI)組49例，所有入組患者均行冠脈造影檢查。冠心病診斷參照世界衛生組織1979年《缺血性心臟病的命名和診斷標準》和中華醫學會心血管病學分會2007年《不穩定性心絞痛和非ST段抬高心肌梗死診斷與治療指南》。排除標準：合并有急慢性感染性疾病、惡性腫瘤、肝腎功能不全、血液病、周圍血管性疾病、自身免疫疾病、腦卒中、其他心臟疾病的患者及既往心肌梗死、冠狀動脈支架植入術術后或冠狀動脈旁路移植術術后的患者。

1.2 方法

1.2.1標本采集 在患者入院后、未進行任何干預措施前，采集肘靜脈血，將EDTA-K2真空采血管中全血，4 000 r/min離心15分鐘，分離血漿于無RNA酶的EP試管中，置于-80℃冰箱保存。

1.2.2全球急性冠狀動脈注冊事件危險評分(GRACE評分) 計算年齡、心率、動脈收縮壓、肌酐、ST段變化、Killip分級、心肌標志物是否升高及入院時是否心臟驟停等8項指標積分之和。

1.2.3冠脈Gensini評分 對每支冠狀動脈病變狹窄程度進行定量評定，以每一冠狀動脈的狹窄基本評分乘以該病變部位的系數，即為該病變血管的評分，各病變血管得分總和即為該患者冠狀動脈病變狹窄程度的總評分。

1.2.4試劑與儀器 EasyPure miRNA Kit(#ER601,TransGen Biotech)試劑盒，TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(#AT311,TransGen Biotech)試劑盒，Light Cycler 480 SYBR Green IMaster(#04707516001,Roche)。羅氏480PCR擴增儀。

1.2.5miRNA檢測 血漿miRNA提取及逆轉錄等操作步驟嚴格按照試劑說明書進行。所有操作步驟均在冰上完成，避免RNA的降解。以U6作為標準內參，進行實時熒光定量PCR，反應體積為20 μl,包括5 μl逆轉錄產物，10 μl Master Mix，正向引物1 μl，反向引物1 μl，3 μl無核酸酶水，反應條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，45個循環，每份樣本設置3個重復孔，使用2-△Ct法分析miR-126和miR-92a的相對表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 基本資料

總共研究了93名患者，non-CAD組20人，AP組24人，AMI組49人。值得注意的是，非冠心病組并不是健康對照組，因無法對健康人群進行冠脈造影及采血，非冠心病組是通過臨床表現懷疑為冠心病，但通過冠脈造影而排除的人群。AMI組較其他兩組吸煙患者的百分率顯著增加，高敏肌鈣蛋白T(hs-cTnT)和GRACE評分明顯升高，左室射血分數明顯降低。Gensini積分AMI組明顯高于AP組，AP組顯著高于non-CAD組(表1)。

2.2 血漿中miRNA的相對表達量

如表1所示，在非冠心病、心絞痛和心肌梗死三組中患者血漿中miR-92a和miR-126水平呈遞降趨勢，miR-92a水平AP組較non-CAD組顯著降低，差異有統計學意義(P=0.01)；AMI組較AP組有所下降，但差異無統計學意義(P=0.079)。而miR-126水平，AP組與non-CAD組相比略降低，差異無統計學意義(P=0.212)；AMI組較AP組顯著降低，差異有統計學意義(P=0.013)。

2.3 miRNA與其他臨床指標的相關性

進一步分析miR-92a和miR-126與其他臨床特征之間的關系，發現MiR-92a和miR-126表達與hs-cTnT、Gensini評分、GRACE評分呈負相關，而與EF呈正相關(表2)。

注：a與其他兩組相比，P<0.05。

表2 r值表

2.4 miRNA在冠心病中的診斷價值

繪制miR-92a，miR-126與miR-92a+miR-126對冠心病或心梗診斷的受試者工作曲線，計算曲線下面積，并以約登指數最大值處為最佳診斷界值，CHD的診斷界值為miR-92a≤18.17，miR-126≤15.71，AMI的診斷界值為miR-92a≤18.17，miR-126≤16.41，聯合診斷時，任一指標低于診斷界值即診斷為陽性，各指標診斷的敏感度、特異度、準確度見表3。

表3 miR-92a和miR-126的診斷價值

3 討論

本文結果顯示，在非冠心病、心絞痛和心肌梗死三組中患者血漿中miR-92a和miR-126水平呈遞降趨勢，即miR-92a和miR-126水平隨冠心病的嚴重程度的增加而降低，血漿miR-92a水平在AP和AMI患者中明顯下降，而miR-126則在心梗患者中顯著降低。表2表明血漿miR-92a和miR-126水平與hs-cTnT顯著相關，提示其表達水平在冠心病患者中的降低可能與心肌損傷程度有關。在排除血壓及其他心臟疾病的影響后，血漿miR-92a和miR-126水平與左室射血分數呈正相關，也提示miR-92a和miR-126與心臟功能的相關性可能是由于心肌損傷造成。

Rosa等人發現內皮細胞富含的miR-126的循環濃度的跨冠脈降低與心肌損傷的程度直接相關。內皮細胞富含的miR-126表現出逆冠狀動脈內濃度梯度，表明肌鈣蛋白陽性冠心病患者miR-126在通過冠脈循環期間被攝入或降解，并且觀察到內皮細胞富集的miR-92a存在類似的模式[4]。影響血漿miRNA的水平可能包括轉錄、翻譯、組織表達量、蛋白加工和釋放等多方面因素，并且不同的miRNA有各自特異的釋放和轉運機制[6]。很多miRNA存在于不同的細胞外囊泡中，這些miRNA由囊泡保護而不被RNA酶降解[7,8]。另有一些miRNA可與蛋白質結合，如miR-92a與Argonaute-2蛋白結合后釋放或與脂質蛋白結合后轉運[9]，這些復合物可以使miRNA在一定程度上保持不被RNA酶降解。不同的保護機制導致不同的降解率：如與蛋白質結合的miRNA對可以被心梗后釋放的蛋白酶水解，而囊泡內的miRNA對蛋白酶不敏感。因此，當心肌損傷時蛋白酶[10,11]或RNA水解酶[12,13]分泌增加，則可導致血漿miRNA水平降低。

表2表明患者血漿miRNA表達水平與冠脈病變程度呈明顯負相關，Gensini積分越高，miR-92a和miR-126表達水平越低。目前研究認為miR-92a是內皮細胞源性血管形成抑制物[14]，在心肌缺血或肢端缺血的小鼠動物模型中其抑制血管形成作用更明顯，miR-92a過表達可以減少抗粥樣硬化血流調控性轉錄因子KLF2/4的表達，從而參與內皮損傷過程，當存在動脈粥樣硬化時，心肌組織中富集miR-92a，相反，因上述轉運機制的不同導致釋放入血的miR-92a減少[6]。Andreas等人的研究結果表明，內皮細胞中miR-126通過抑制印記基因Dlk1維持內皮細胞的增殖儲備，從而防止動脈粥樣硬化病變形成[15]。也有研究表明在動脈粥樣硬化層流剪切力的作用下，內皮釋放的miRNA-126減少[16]。

GRACE風險評分可以準確預測冠心病患者院內臨床結局和遠期臨床結局[17]。對于低、中、高危患者，院內死亡風險分別為<1%,1%-3%,>3%。出院后6個月死亡風險分別為<3%,3%-8%,>8%。本文研究顯示血漿miR-92a和miR-126水平與GRACE風險評分呈負相關，提示血漿miR-92a和miR-126水平可能與預后相關。Karakas等人研究結果也表明miRNA水平與心肌梗死后患者的心血管預后相關，在首次前瞻性研究中發現，miR-126水平與隨后發生的心梗呈負相關，并且miR-126的表達預測了一組具有癥狀的冠狀動脈疾病患者的死亡率[18]。

本研究發現在對急性心梗進行診斷時，最佳診斷界值為miR-92a≤18.17，miR-126≤16.41，但與現有指標如hs-cTnT相比，診斷效力并不理想，二者聯合診斷靈敏度為89.80%，特異度為59.09%，準確度為75.27%。雖然不穩定性心絞痛患者miR-92a的相對表達水平高于急性心梗患者，但是本研究得出的對冠心病的最佳診斷界值仍為miR-92a≤18.17，這可能是由于各組人數不均且非冠心病患者較少的原因。miR-92a與miR-126聯合對冠心病診斷效力最佳，靈敏度為78.08%，特異度為80.00%，準確度為78.49%，由于miRNA檢測的經濟、便捷、微創等優點，或許可以作為冠心病早期發現的參考指標。此外，本研究中非冠心病組并非健康體檢者，可能對結果造成影響，因此，今后需擴大樣本量進一步研究。