基于SELDI-TOF-MS技術篩選乳腺癌血清蛋白標志物

孫亞冬，王家祥，崔樹德*

(鄭州大學附屬腫瘤醫院 1.乳腺科；2.外科，河南 鄭州450008)

乳腺癌是全球范圍內女性最常見的惡性腫瘤，死亡率僅次于肺癌為第二位[1]。乳腺癌的預后與疾病分期及生物分型密切相關，目前早期診斷仍然是治愈的關鍵[2]，如何尋找敏感性高、特異性高并且可以用于早期診斷和篩查的生物指標，發現尚處于亞臨床病變階段的腫瘤對臨床意義重大[3,4]。本研究通過收集乳腺癌患者和正常健康女性的血清標本，應用表面增強激光解析離子化飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術，分別研究乳腺癌術前組與健康對照組、乳腺癌術前組與術后組、三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組之間血清蛋白質譜的變化特征，以期尋找到相關的血清蛋白質標記物，進而對于乳腺癌的早期診斷、療效評價及不同亞型的預后分析提供一定幫助。然后聯合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE和Western blot 等多種蛋白質組學技術對篩選出的目標蛋白質進行鑒定和驗證，最終確定乳腺癌血清特異蛋白標記物，從而為乳腺癌的早期診斷及三陰性乳腺癌的潛在靶點尋找依據和參考。

1 材料與方法

1.1 血清樣本收集與處理

收集鄭州大學附屬腫瘤醫院女性乳腺癌患者資料總計60例，時間自2011年06月至2014年6月，其年齡范圍為23-70歲，平均年齡為46.7+0.4歲，病理明確診斷為乳腺癌，所有患者入組前未接受治療，診斷明確后均接受手術治療，術后規范接受化療、放療或內分泌治療。其中確診為三陰性乳腺癌的患者占22例。同時收集健康女性的血清樣本20例，設為健康對照組。所有參與實驗的患者及健康對照者，都已了解相關內容，并征得知情同意。

入組乳腺癌患者術前、對應術后2周的標本，兩組均為60例。所有患者均在清晨06:30-7:30抽血留取標本，要求空腹狀態，標本于室溫下靜置0.5-1 h，然后放入離心機進行離心，轉速3 000 r/min，離心時間20-30 min，離心后標本抽取上清液至EP管，做好標記后放入-80℃冰箱保存。

1.2 儀器和設備

SELDI-TOF-MS、96孔蛋白芯片(Bioprocessor)、SELDI芯片、WCX芯片、CHAPS(3-環乙胺-1-丙磺酸)、乙腈(Acetonitrile)、DTT(1,4-二硫代蘇糖醇)、TEMED(四甲基乙二胺)均購于美國Ciphergen公司，MALDI-TOF-MS購于英國Kratos Analytical公司，真空冷卻離心濃縮系統(SPD SpeedVac)購于美國Thermo Electron Inc公司，胰蛋白酶(Trypsase)于美國Promega Inc公司。

1.3 方法

1.3.1血清樣本的處理 解凍血清標本，室溫下溶解，然后離心(4℃，10 000 r/min)，將離心后的樣本加入96孔細胞培養板，每孔加入5 μl樣本，然后加入10 μl U9緩沖液，并加入1% Bar、2%CHAPS各10 μl，放入4℃層析柜內，振蕩大約30 min，500 r/min。

1.3.2SELDI-TOF-MS技術篩選血清樣本 將芯片裝入加樣器Bioprocessor中，每孔中加入NaAC(100 mmol/L，pH4)200 μl，放入層析柜中，以600 r/min振蕩2 min，然后重復上述操作過程1次。將經過U9處理后的96孔板Bioprocessor置于冰盒上，加入NaAC185 μl，這一步驟使用排槍操作，然后再次放入層析柜中，4℃條件下，600 r/min震蕩2 min。在蛋白質芯片上加入已處理的樣本100 μl，放置于層析柜中，4℃條件下，600 r/min結合60 min，然后甩去殘液，快速拍干。加入NaAC200 μl，600 r/min振蕩5 min后，方法同前，以上操作重復3次。使用200μl去離子水將各孔沖洗兩次，仔細甩干，將芯片風干，每孔加入50%飽和的SPA 1 μl，分兩次進行，等待芯片干燥后上機。設置參數如下：分子量范圍為2000Da-20000Da，最高分子量為30000Da，使用Ciphergen Biosystems 軟件(3.1版)校正原始試驗數據，使數據的總離子強度和分子量實現均一化；使用Biomarker Wizard軟件包和ZUCI-ProteinChip Data軟件包來過濾噪音和去除基線。并檢測儀器的運行情況及靈敏度，然后把裝有檢測樣本的蛋白質芯片板放入質譜儀中，通過MELDI-TOF-MS系統，進行數據收集，并應用相應軟件對數據進行處理，分別獲取到各個樣本的m/z峰(質/荷比)，數據中差異性<0.3% 的被認為是同一種蛋白質。

1.3.3乳腺癌血清中特異性蛋白質的鑒定 根據SELDI-TOF-MS篩選出的乳腺癌特異性蛋白質標記物，即(m/z)位于6448的蛋白質或肽段，選取6448的蛋白質或肽段峰值高表達的血清樣本進行純化及鑒定。對樣本進行篩選后制備凝膠，收集乳腺癌組樣品血清2 ml，然后加入超純水，稀釋至5 ml，再進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE)分離，步驟如下：把兩塊玻璃板(厚度為0.75 mm)清洗干凈，夾緊固定于膠架上，先后加入分離膠和濃縮膠，需要等待膠體完全凝固后進行上樣，將5 μl指示劑加入到前期處理后的樣本中，沸水浸泡，約15-20 min，取出，然后5000 r/min離心，時間5 min，然后取上清液10 μl，小心加至膠體梳齒槽中，將Marker加入第一槽作為參照。然后將初始電壓設為30 v，待樣本電泳到濃縮膠與分離膠的分界處時，調至電壓為100 v，繼續電泳4-6 h小時以后，等待指示劑接近膠體底部的時候，關掉電源，取出玻板，將濃縮膠和分離膠進行分離，濃縮膠進行移除，仔細分離分離膠并放入清潔培養皿中進行考馬斯亮蘭染色，染色時間為6-8小時。將染色成功后的分離膠進行切取，用標記好的EP管分裝。參照膠內酶解試劑盒的說明書，經酶解得到目標蛋白。向樣本中加入提取液，然后對上清液進行提取，將基質添加至上清液后，在蛋白質芯片板上進行點樣，然后放入MALDI-TOF/TOF中，經過激光轟擊，肽段序列進行收集，然后利用Mascot軟件，繼而與Swiss Prot數據庫連接、進行匹配和比對，最終得到目標蛋白質。

1.4 統計學方法

對質譜原始數據進行處理，通常通過噪音過濾和聚類分析，對篩選出的m/z峰進行統計學檢驗，采用Wilcoxon秩和檢驗，并對不同實驗組質譜數據進行t檢驗，檢驗水準α=0.01。

2 結果

2.1 乳腺癌組與健康對照組間的比較

將乳腺癌組與健康對照組之間的蛋白質譜進行標準化處理后，再進行聚類分析，得到兩組各自的差異蛋白峰值，然后對兩組蛋白峰值進行Wilcoxon秩和檢驗，共收集到14個具有差異性的蛋白峰值(P<0.01)，其中有11個在乳腺癌組呈高表達，3個在乳腺癌組呈低表達。通過SVM回歸，篩選出其中Youden指數最高的模型，差異蛋白峰為定位于6448的蛋白質標記物，與健康人群相比，在乳腺癌患者中，m/z峰定位于6448的蛋白標記物低表達。其在乳腺癌組低表達強度為38.0187±34.2194，而在正常組高表達，表達強度為337.5261±507.6438，差異有顯著的統計學意義(圖1、2)。

圖1 m/z 6448 在各組中的對比質譜圖(0為正常組，1為乳腺癌組)

圖2 m/z 6448 在不同組中的模擬電泳圖，紅色條帶處(0為正常組，1為術前組)

2.2 乳腺癌術前組與術后組間的比較結果

對乳腺癌術前組與術后組進行質譜分析，得到具有差異性的蛋白質峰值(P<0.01)，共篩選出6個，其中有4個在乳腺癌術前組呈高表達，2個低表達。通過支持向量機(SVM)，將Youden指數最高的模型篩選出來，最終得到m/z峰位于6448的蛋白標記物，其在術前組表達強度為38.0187±34.2194，術后組表達強度為294.1245±102.8634，差異具有統計學意義(圖3、4)。

2.3 三陰性乳腺癌組與非三陰性乳腺癌組的比較結果

采用SELDI-TOF-MS技術平臺對三陰性乳腺組與非三陰性乳腺癌組進行質譜分析，得到具有差異性的蛋白質峰值(P<0.01)，共篩選出9個，其中有4個在三陰性乳腺癌組低表達。通過SVM篩選出Youden指數最高的模型，也可以得到m/z峰位于6448的蛋白標記物，其在三陰性乳腺癌中表達強度為5.1351+3.6437，非三陰性乳腺癌組表達強度為43.6162±18.8542，兩組比較差異具有統計學意義(P=0.000163，<0.01)(圖5、6)。

圖3 m/z 6448在各組中的對比質譜圖(0為乳腺癌術前組，1為術后組)

圖4(m/z) 6448在不同組中的模擬電泳圖，紅色條帶處(0為術前組，1為術后組)

圖6 m/z 6448在不同組中的模擬電泳圖，紅色條帶處(0為非三陰性乳腺癌組，1為三陰性乳腺癌組)

2.4 特異性蛋白質的鑒定

以Marker所提供的分子量作為參照標尺，切取相對應的分子量軸上目標蛋白條帶，然后進行酶解離心，再取上清液，使用MALDI-TOF/TOF技術獲取到肽段混合物并對其進行檢測鑒定。結果顯示，含有m/z6448的純化液經過檢測得到的蛋白片段(表1)，將檢測出的m/z為6448Da的蛋白質肽段樣品進行酶解，然后通過MALDI-TOF/TOF系統進行肽段檢測。m/z為6448 Da的蛋白質或肽段其序列為：LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK，將肽段導入SEQUEST檢索程序并在Bioworks數據庫檢索，此肽段為載脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,APO C-I)。圖7為鑒定m/z為6448Da的蛋白質或肽段酶解的部分肽段的質譜圖。

表1 質荷比為6448Da的蛋白質或肽段及其酶解后的肽段序列

圖7 鑒定質荷比為6448Da的蛋白質或肽段酶解的部分肽段質譜圖

3 討論

本研究通過SELDI-TOF-MS蛋白質芯片技術篩選出質荷比(m/z)為6448的蛋白質峰，然后聯合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE等技術對篩選出的目標蛋白質進行鑒定和驗證，質荷比6448蛋白質為載脂蛋白C-I肽段(ApoC-I)。同時發現載脂蛋白C-I肽段在乳腺癌患者血清中明顯降低，顯著低于健康對照人群；而患者術后血清中載脂蛋白C-I肽段有上升趨勢；在三陰性乳腺癌組表達低于非三陰性乳腺癌組。這一結果不僅發現了可以用于乳腺癌早期診斷和檢測預后的新型生物指標，而且提示我們載脂蛋白ApoC-I肽段對乳腺癌有一定的保護性作用，載脂蛋白ApoC-I肽段與腫瘤細胞增殖分化可能呈負相關。因為我們看到作為乳腺癌亞組中惡性程度最高、侵襲性最強、轉移能力最強的三陰性乳腺癌組，這一蛋白質肽段的表達更低，它的生物學作用和機制需要進一步探索。

三陰性乳腺癌約占乳腺癌的15%-20%，是乳腺癌所有分子分型里預后最差、復發轉移風險最高的一種亞型，因為缺乏有效的治療手段，僅僅對化療敏感，內分泌治療和分子靶向治療均不敏感，因此，三陰性乳腺癌的治療一直是困擾臨床多年的難題，目前越來越多的研究試圖尋找三陰性乳腺潛在的治療靶點[5,6]。我們的研究發現m/z峰定位于6448的蛋白標記物在侵襲性較高的三陰性乳腺癌中表達低于非三陰性乳腺癌，這也提示我們這一蛋白標記物的降低與乳腺癌腫瘤惡性程度的升高可能相關，初步建立了SELDI-TOF-MS蛋白質芯片技術結合SVM的乳腺癌血清尤其是三陰性乳腺癌血清蛋白篩選模型[7]。

目前，關于載脂蛋白與腫瘤關系的研究還非常少，以往對于載脂蛋白的研究主要集中在其對脂蛋白代謝的調節上[8-10]，近年來有一些研究報道了載脂蛋白C-I在細胞功能調節方面的作用，除了在脂質代謝方面的作用，一些激酶可以被載脂蛋白C-I激活或抑制，進而實現調節生理或病理過程的作用，與癌癥的發生發展有關。Yasui等[11]通過基因表達分析(SAGE)發現與正常胃上皮細胞相比，載脂蛋白C-I在胃癌細胞中表達上調等。Christine等[12]通過對胰腺癌組織進行原位雜交發現，載脂蛋白C-I在侵襲性胰腺癌組織中高表達。Yamamoto-Ishikawa等[13]對激素耐藥的前列腺癌進行研究，發現載脂蛋白C-I定位于這類前列腺癌的細胞質中，在疾病進展過程中血清載脂蛋白C-I蛋白表達水平升高。這些結果都表明載脂蛋白C-I可能參與了多種類型的癌癥的發生及發展過程，目前參與發病的確切機制還不清楚，值得進一步探討。Goncalvesa等[14]一項對乳腺癌術后病人血清蛋白質組學研究，篩選并鑒定出差異蛋白質為載脂蛋白AI和載脂蛋白CI，并且發現兩者在術后復發轉移組均呈低表達。這一結論和我們的研究結果非常類似，均提示載脂蛋白CI的低表達可能與乳腺癌較差的預后有關。同時再次印證了血清蛋白質組學研究對于預測乳腺癌復發轉移有一定積極的臨床意義。

綜上所述，ApoC-I肽段在乳腺癌患者中明顯低于健康人群，術后隨著瘤荷的降低ApoC-I肽段隨之升高，而且在侵襲性較強、惡性程度較高的乳腺癌亞型中ApoC-I肽段的表達更低，是因為腫瘤的發生導致ApoC-I的表達量消耗性下降，還是因為ApoC-I的表達量下降而導致腫瘤的發生，二者之間的作用機制及原理，均有待更深入研究。