淋巴單核比、淋巴細胞亞群在多發性骨髓瘤患者外周血的表達分析及與預后的關系

程盼盼,王翠玲,張向暉,楊春燕*,竇翠云

(濟寧醫學院附屬醫院 1.血液科；2.檢驗科，山東 濟寧272000)

骨髓造血微環境(包括造血干細胞、T、B、NK淋巴細胞、單核細胞)以及腫瘤免疫逃逸在多發性骨髓瘤(MM)的發病以及疾病進展中起重要作用[1,2]。 而淋巴單核細胞比在惡性腫瘤預后評估中有重要作用[3]。本研究采用流式細胞術檢測57例多發性骨髓瘤患者及30例健康志愿者淋巴、單核細胞淋巴細胞亞群(T、B、NK、NKT及CD4/8雙陰性、雙陽性T淋巴細胞)，分析多發性骨髓瘤患者淋巴/單核細胞比、以及各淋巴細胞亞群的水平以及與β2-微球蛋白和白蛋白水平的相關性，探討其在MM預后的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

以濟寧醫學院附屬醫院血液科2015年1月-2017年6月住院診治的57例多發性骨髓瘤患者為研究組，所有診斷均符合張之南主編《血液病診斷及療效標準》第3版中的國內診斷標準，其中男性33例，女性24例，中位年齡61歲(60.83±9.01，37-77歲)。依據患者免疫球蛋白進行分型，IgG型27例， IgA型25例，IgD1例，輕鏈4例；依據國際ISS標準分型，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期22例；選取30例健康志愿者為對照，其中男性20例，女性10例，中位年齡60歲(59.27±7.51，36-71歲)。

1.2 主要試劑和儀器

CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC，CD3 FITC/CD16+56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 以及溶血素為美國BD公司，流式細胞儀BD FACS Calibur，全自動生化分析儀(羅氏)，全自動血細胞分析儀(Sysmex 2100)。

1.3 實驗方法

所有觀察對象均于清晨空腹采取靜脈血，置于EDTA-K2抗凝管，用于全血細胞分析、淋巴亞群分析及檢測白蛋白和β2-MG。

1.4 淋巴亞群檢測

在BD記數管中準確加入10 μl四色熒光試劑(CD3/8/45/4，CD3/16+56/45/19)和50 μl全血，充分混勻后置避光室溫孵育30 min 加入2 ml 1×CD3/8/45/4，以及CD3/16+56/45/19血液，充分混勻后室溫避光孵育10 min，300 g離心5 min，2 ml PBS 300 g離心5 min，加入450 μl PBS，24 h內上機檢測。獲取及分析采用Cellquest軟件，檢測時，每個樣本測定管獲取淋巴細胞數10000個，分析淋巴亞群。

免疫比濁法檢測患者β2-MG，溴甲酚綠法檢測血清白蛋白水平；全自動血細胞分析儀檢測白細胞分類計數及 血紅蛋白濃度，計算淋巴單核細胞比值。

1.5 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件包進行統計分析，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗， 各參數相關性采用Spearman相關性檢驗。以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各指標與正常對照相比

與正常對照相比(見表1)，MM病例組LMR減低，而淋巴細胞亞群中總T，Ts細胞較正常對照增高，其中CD4/8雙陽性及雙陰性T淋巴細胞均較正常對照組增高，且差異具有統計學意義，B淋巴細胞較正常減低，雖然NK細胞MM組較正常組增高，但差異無統計學意義。

2.2 相關性研究

分析淋巴單核比及各淋巴亞群與白蛋白、β2-MG的相關性，發現T淋巴細胞亞群及Ts與白蛋白呈正相關(R=0.293，P=0.027；R=0.257，P=0.005)，CD4/8雙陰性T淋巴細胞與β2-MG正相關(R=0.442，P=0.001)，NK細胞與白蛋白呈負相關(R=-0.280，P=0.035)。見圖1-4。

表1 MM組 與正常對照組淋巴單核比以及淋巴亞群檢測值

3 討論

淋巴細胞和單核細胞均為機體的免疫細胞，他們通過局部免疫抑制和抑制血管生成改變了腫瘤微環境，低淋巴細胞計數被證實與不同類型癌癥患者的總生存期呈負相關，而高單核細胞計數是惡性腫瘤患者預后差的因素之一。淋巴/單核比(LMR)作為腫瘤患者常規進行的、經濟便利的檢測指標，可以早期對患者的預后做出一定程度的評估[3]。 在MM病例中，LMR可作為無進展期生存(PFS)以及總生存期的(OS)檢測指標，Alessandra Romano等人觀察并隨訪了208例MM患者，將3.6作為LMR的最佳臨界值，發現初診LMR低于3.6的患者其無進展期生存要低于LMR大于3.6的患者[4]。我們結果提示MM患者LMR比健康對照要低，但沒有發現與白蛋白、微球蛋白相關，提示LMR與MM疾病的發病有關，但與其他指標的相關還有待于進一步研究。

圖1CD4/8雙陰性T淋巴細 圖2T淋巴細胞與白蛋白 圖3Ts淋巴細胞與白蛋白圖4NK淋巴細胞與白蛋胞與β2-微球蛋白相關性相關性相關性白相關性

B細胞通過中和作用、調理作用、激活補體的方式介導機體體液免疫應答。此外，B淋巴細胞可加工提呈可溶性抗原給T淋巴細胞，活化的B細胞還可以分泌各種細胞因子調節機體免疫功能。本研究結果顯示，MM 患者體內CD19細胞的表達明顯低于正常對照組。說明MM患者機體存在體液免疫功能的低下和免疫調節功能的異常。B細胞相關抗原作為CART的靶點在MM治療中有效提示B淋巴細胞與MM的疾病進展相關[5]。有研究證實骨髓中單個核細胞中B淋巴細胞誘導成熟蛋白-1(Blimp1)的表達與多發性骨髓瘤預后呈負相關[6]，提示B淋巴細胞在MM的疾病進展中有作用。但在與白蛋白以及微球蛋白相關性研究中沒有發現相關性，與其他指標的相關性還有待于進一步研究。

研究發現，MM伴有T淋巴細胞的表型和功能異常[7]，高鵬等人在對MM的研究中發現，NK、調節T淋巴細胞以及CD8+T淋巴細胞的比例增高，B淋巴細胞、CD4/CD8比值降低[8]。在我們的研究結果中，除CD8+細胞增高，B淋巴細胞和CD4/CD8比值減低外，T淋巴細胞中CD4/8雙陽性及雙陰性T淋巴細胞比例也增高。CD4/8雙陽性T淋巴細胞雖然比例低，對其研究也少見，但是在抗病毒免疫中發揮作用，研究指出CD4/8雙陽性細胞含有記憶淋巴細胞對潛在高水平病毒感染抗原的特異效應器[9]，而CD4/8雙陰性細胞通過穿孔素以及細胞-細胞間的作用抑制B淋巴細胞的增殖從而免疫球蛋白和抑制免疫反應。我們的研究結果T淋巴細胞與Ts細胞與白蛋白呈正相關，提示T淋巴細胞以及Ts細胞的增高與MM的預后相關。CD4/8雙陽性以及雙陰性T淋巴細胞在MM中的作用以及對其免疫功能的影響也將是我們進一步研究的內容。

我們的研究結果中，NK淋巴細胞比例增高，差異無統計學意義，但是，MM中NK淋巴細胞活性減低，研究證實，骨髓瘤細胞來源外泌體在對NK 細胞功能的抑制中起到了重要作用[10]。而我們的研究中發現NK細胞與白蛋白呈負相關，也間接證實了NK淋巴細胞與MM的疾病進展相關。

綜上所述，LMR以及淋巴亞群在MM中的異常水平提示MM的免疫功能紊亂，而淋巴亞群與MM分期相關的白蛋白、β2-微球蛋白相關，提示淋巴亞群的變化與MM的預后相關。