SATB1在食管鱗狀細胞癌組織中的表達及意義

李立明 張秋瑩 栗四方 花光斌 李向楠

[摘要]目的 探討AT富集序列特異性結合蛋白1（SATB1）在食管鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）組織中的表達及意義。方法 選取食管鱗癌病人103例，采用免疫組化法檢測鱗癌及癌旁組織中SATB1蛋白表達。培養人食管鱗癌Eca109細胞，將其隨機分為siRNA-SATB1組、siRNA-對照組和空白對照組，采用實時熒光定量PCR技術檢測細胞中SATB1基因表達，MTT法檢測細胞增殖能力，Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力。結果 食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達率高于癌旁組織，差異有統計學意義（χ2=33.669，P<0.05）;與高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未發生淋巴結轉移組織比較，中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達率顯著升高（χ2=14.766～27.333，P<0.05）。siRNA-SATB1組細胞中SATB1 mRNA相對表達量顯著低于siRNA-對照組和空白對照組（F=172.993，P<0.05）;siRNA-SATB1組細胞培養24、48、72和96 h時的吸光度值均顯著低于siRNA-對照組和空白對照組（F=10.286～29.154，P<0.05）;siRNA-SATB1組24和48 h時劃痕愈合率、侵襲細胞數均顯著低于siRNA-對照組和空白對照組（F=62.696～136.852，P<0.05）。結論 食管鱗癌組織中SATB1蛋白呈高表達，且參與腫瘤惡性進展，沉默SATB1基因可減少食管鱗癌細胞增殖，抑制鱗癌細胞遷移和侵襲。

[關鍵詞]食管腫瘤;癌，鱗狀細胞;核基質相關蛋白質類;細胞增殖;腫瘤侵襲;腫瘤轉移

[中圖分類號]R735.1

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0572-05

doi：10.11712/jms201905017

[開放科學（資源服務）標識碼（OSID）]

食管癌作為我國高發的惡性腫瘤，具有發病率高、轉移率高、生存率低、預后差等特點，是嚴重威脅我國人群健康的重要腫瘤類型[1-2]。鱗狀細胞癌（簡稱鱗癌）是我國食管癌的主要病理學類型，占食管癌的90%以上[3]。目前，食管鱗癌的具體發病機制尚沒有完全的清楚。AT富集序列特異性結合蛋白1（SATB1）作為新近發現的一種基因調節因子，是在細胞或組織中特異性表達的核基質結合域DNA結合蛋白，與細胞增殖、分化、凋亡關系密切[4]。近年來研究發現，SATB1參與了多種惡性腫瘤的侵襲、轉移過程[5-7]。本研究通過檢測SATB1蛋白在食管鱗癌及癌旁組織中的表達情況，探討其表達與食管鱗癌病人臨床病理特征之間的關系，并利用小分子干擾RNA（siRNA）技術沉默SATB1基因，觀察SATB1基因沉默后食管鱗癌Eca109細胞增殖和運動能力的變化情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年3月—2017年4月，選擇在我院擇期行手術治療的食管鱗癌病人103例作為研究對象，所有研究對象術前均未進行放化療，術后經病理學檢查明確診斷為食管鱗癌。其中，男性62例，女性41例;年齡43～74歲，平均（59.2±12.6）歲;腫瘤部位：食管上段26例，中段52例，下段25例;分化程度：中低分化77例，高分化26例;TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期56例;發生淋巴結轉移63例。手術過程中取腫瘤組織及距離腫瘤>5 cm的癌旁組織，用甲醛固定后石蠟包埋保存。

本研究獲我院倫理委員會批準，病人或近親屬對研究方案知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和設備

兔抗人SATB1多克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒購自上海拜力生物科技公司，人食管鱗癌Eca109細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所，RPMI-1640培養液、脂質體2000轉染試劑盒、胎牛血清和總RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑及PCR試劑購自大連寶生物公司，SATB1及內參引物由上海生工生物公司設計合成，SATB1干擾序列、對照序列均由上海吉瑪制藥有限公司設計合成，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，Transwell小室購自北京樂博生物科技公司，實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 研究方法

1.3.1 鱗癌及癌旁組織中SATB1蛋白表達的檢測

按照SP免疫組化試劑盒說明進行操作。將石蠟標本切片（約厚4 μm）脫蠟、梯度乙醇水化，加入體積分數為0.03的過氧化氫溶液，滅活內源性過氧化物酶，以微波加熱進行抗原修復，使用山羊血清封閉15 min，加入兔抗人SATB1多克隆抗體（1∶800稀釋），在4 ℃條件下過夜孵育，以PBS沖洗3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木精復染，透明后封片，顯微鏡下觀察。隨機取5個高倍視野，按半定量法判定結果。按染色強度評分：0分，無著色;1分，染成淡黃色;2分，染成黃色;3分，染成棕褐色。按陽性細胞比例評分：0分，陽性細胞≤5%;1分，陽性細胞6%～25%;2分，陽性細胞26%～50%;3分，陽性細胞>50%。根據染色強度得分和陽性細胞比例得分乘積判定結果：0～1分為陰性，2～9分為陽性[8]。每張切片均由兩位病理科醫師采用盲法獨立完成判定。

1.3.2 細胞培養及處理 Eca109細胞置于含體積分數0.10胎牛血清的RPMI-1640培養液中，在含體積分數0.05 CO2的37 ℃恒溫培養箱中培養，當細胞融合度>80%時進行消化、傳代。取對數生長期細胞進行分組并轉染：空白對照組（A組）細胞只加入培養液;siRNA-對照組（B組）細胞轉染siRNA對照序列;siRNA-SATB1組（C組）細胞利用脂質體2000轉染試劑盒轉染SATB1基因的干擾序列。SATB1基因的干擾序列和對照序列見表1。細胞轉染后繼續培養48 h。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測細胞中SATB1基因表達 取3組轉染后48 h細胞，裂解，提取總RNA，并檢測總RNA純度。按逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，按PCR試劑盒說明書以cDNA為模板對引物進行擴增。引物序列見表2。PCR反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、30 s，53 ℃、30 s，60 ℃、30 s，連續進行40個循環。用2-△△Ct法計算細胞中SATB1基因表達量[9-10]。

1.3.4 MTT法檢測細胞增殖能力 取3組細胞，消化，按每孔5×103個接種于96孔板中，繼續培養。分別于培養12、24、48、72和96 h時，將MTT液20 μL加入各孔，孵育4 h，棄去上清，將二甲基亞砜150 μL加入各孔，振蕩反應15 min，于酶標儀上檢測490 nm波長處各孔吸光度（A）值[11-12]。

1.3.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 取各組細胞，消化，離心，用無血清培養液重懸細胞，按每孔105個接種于6孔板中，待細胞貼壁融合度達90%以上時，用200 μL的移液器槍頭劃痕，以PBS沖洗3次，去除漂浮的細胞，加入無血清培養液繼續培養，分別于培養0、24和48 h時，用顯微鏡觀察并測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-24或48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.3.6 Transwell法檢測細胞侵襲能力 用無血清培養液按1∶10稀釋Matrigel膠，平鋪于上室，風干備用。取各組轉染后培養48 h細胞，用無血清培養液培養12 h，消化，用無血清培養液按109/L重懸細胞。取細胞懸液200 μL加入上室，下室則加入含體積分數0.10胎牛血清的培養液500 μL，恒溫培養12 h，乙醇固定10 min，結晶紫染色，將小室內散落的細胞用棉簽拭去，鏡下隨機取10個視野觀察穿膜細胞數[13-14]。

1.4 統計學分析

使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。計量資料以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗;計數資料組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 食管鱗癌及癌旁組織中SATB1蛋白表達

SATB1蛋白主要表達于食管鱗癌細胞核和細胞質中，以細胞質中為主，見圖1。SATB1蛋白在食管鱗癌組織中的陽性表達率為78.6%，顯著高于癌旁組織的38.8%（χ2=33.669，P<0.05）。

2.2 SATB1蛋白表達與食管鱗癌臨床病理特征的關系

不同性別、年齡、部位和浸潤深度的食管鱗癌組織SATB1蛋白表達差異無顯著性（P>0.05）;與高分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和未發生淋巴結轉移組織比較，中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移的食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達率顯著升高（χ2=14.766～27.333，P<0.05）。見表3。

2.3 各組細胞SATB1基因表達比較

SATB1 mRNA在siRNA-SATB1組、siRNA-對照組和空白對照組細胞中的相對表達量分別為1.15±0.16、9.25±1.01和9.66±1.17（n=6），差異有統計學意義（F=172.993，P<0.01）。兩兩比較，siRNA-SATB1組細胞SATB1 mRNA相對表達量低于siRNA-對照組和空白對照組，差異有統計學意義（t=10.915、11.117，P<0.05）。

2.4 各組細胞增殖能力比較

與siRNA-對照組和空白對照組比較，siRNA-SATB1組細胞培養24、48、72和96 h時的A值均有顯著降低（F=10.286～29.154，P<0.05），提示siRNA-SATB1組細胞增殖能力被抑制。見圖2。

2.5 各組細胞遷移和侵襲能力比較

siRNA-SATB1組24和48 h時劃痕愈合率、侵襲細胞數均顯著低于siRNA-對照組和空白對照組，差異有顯著意義（F=62.696～136.852，P<0.05）。見表4、圖3。

3 討論

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤，不易早期診斷，加之腫瘤轉移能力強，病人臨床確診時多數已處于中晚期，錯失最佳治療時機[15-16]。盡管近年來食管癌的臨床診療手段不斷提高，但病人5年生存率依然較低，不足30%[17]。因此，近年來食管癌研究重點集中在發現影響腫瘤侵襲、轉移及復發的相關基因或分子機制，以期為食管癌治療干預提供靶標。SATB1基因位于人染色體3p23區，與核基質結合區結合后，在調控基因轉錄、翻譯中發揮重要的作用[18]。有研究表明，SATB1基因在多種惡性腫瘤組織中呈高表達，可作為一種基因調節因子參與腫瘤發生、進展、侵襲及轉移過程[19]。有研究指出，SATB1可以通過調控影響腫瘤發生、進展的多個基因靶位，如Bcl-2、C-myc、基質金屬蛋白酶（MMP）等，而改變腫瘤細胞侵襲性，從而加速腫瘤侵襲、轉移[20]。本研究結果顯示，食管鱗癌組織SATB1蛋白陽性表達率較癌旁組織高，表明SATB1蛋白可能發揮癌基因的作用而參與了食管鱗癌的發生。

本研究結果還顯示，SATB1蛋白在中低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期和發生淋巴結轉移組織中的陽性表達率明顯升高，表明SATB1蛋白高表達與食管鱗癌惡性程度及轉移有關，提示SATB1高表達可能增強了食管鱗癌的侵襲、轉移能力。為進一步探討SATB1對食管鱗癌Eca109細胞系的影響，本研究將SATB1基因特異性沉默，觀察SATB1基因沉默后食管鱗癌Eca109細胞增殖和運動能力的變化情況。結果顯示，siRNA-SATB1組的SATB1 mRNA相對表達量較其他各組均有明顯的降低，提示siRNA-SATB1組細胞SATB1基因表達被成功抑制。siRNA-SATB1組細胞培養24、48、72和96 h時的A值均較siRNA-對照組和空白對照組顯著降低，提示抑制SATB1基因表達后，siRNA-SATB1組細胞增殖能力被顯著抑制[21]。

本文研究結果還顯示，siRNA-SATB1組遷移細胞數和侵襲細胞數較siRNA-對照組和空白對照組均明顯降低，說明沉默SATB1基因表達后，細胞遷移和侵襲能力明顯降低[22]，提示SATB1基因可能與食管鱗癌細胞遷移及侵襲過程關系密切。

綜上所述，食管鱗癌組織中SATB1蛋白呈高表達，且參與腫瘤惡性進展，沉默SATB1基因可減少食管鱗癌細胞增殖，抑制鱗癌細胞遷移和侵襲，有望為食管鱗癌機制研究及基因治療提供新的靶位。

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（本文編輯 馬偉平）