白藜蘆醇對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞

李自立+章若涵

[摘要]目的 探討白藜蘆醇對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用。方法 體外培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs），將細(xì)胞分為血管緊張素組、白藜蘆醇梯度組、聯(lián)合組及對(duì)照組，檢測(cè)評(píng)價(jià)白藜蘆醇和血管緊張素對(duì)VSMCs增殖能力的影響，各組均反應(yīng)0、6、12、24 h，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)來評(píng)價(jià)VSMCs的增殖情況，采用MTT比色法檢驗(yàn)VSMCs活力，對(duì)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 從各組的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果來看，總體結(jié)果為血管緊張素組>聯(lián)合組>白藜蘆醇梯度組>對(duì)照組，其中血管緊張素組VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯著高于對(duì)照組，培養(yǎng)24 h時(shí)，白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)最低（P<0.05），而聯(lián)合組中30、100 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）；從各組細(xì)胞活力情況來看，總體結(jié)果為血管緊張素組>聯(lián)合組>白藜蘆醇梯度組>對(duì)照組，培養(yǎng)24 h時(shí)，同樣白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)最高（P<0.05），而聯(lián)合組中30、100 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）。結(jié)論 白藜蘆醇對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞增殖有著一定的作用，且對(duì)于血管緊張素Ⅱ所誘導(dǎo)的增殖有著較強(qiáng)的抑制效果，不同濃度下作用效果有所差異。

[關(guān)鍵詞]平滑肌細(xì)胞；白藜蘆醇；血管緊張素Ⅱ；細(xì)胞增殖

[中圖分類號(hào)] R965 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）01（b）-0010-03

動(dòng)脈粥樣硬化癥是多種心腦血管疾病的基礎(chǔ)，相關(guān)研究顯示，炎癥因子刺激下主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增生是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要因素[1-2]。近年來紅酒中的提取物白藜蘆醇在心血管疾病防治中的作用逐漸被重視，有學(xué)者研究顯示白藜蘆醇能夠有效抑制冠心病模型大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的程度[3]。血管緊張素Ⅱ是一種生物活性肽，具有較強(qiáng)的收縮血管、刺激心肌肥大的作用，同時(shí)也能夠促進(jìn)VSMCs的增殖，血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下的VSMCs增殖是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)[4]。本文就白藜蘆醇對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用進(jìn)行了研究分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

清潔劑SD大鼠4～5只，均由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；白藜蘆醇、血管緊張素Ⅱ均由美國(guó)Sigma公司提供，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒及MTT試劑盒由北京利維寧生物科技有限公司提供。

1.2原代細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定

采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，采用免疫熒光法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，以出現(xiàn)顆粒狀綠色沉淀為陽性反應(yīng)。

1.3試驗(yàn)方法

選擇3～5代VSMCs進(jìn)行試驗(yàn)，制備細(xì)胞懸濁液，控制密度為5.0×107/L，接種在培養(yǎng)板上待用，在37℃環(huán)境下采用10%胎牛血清進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)24 h后分組，分為血管緊張素組（加入1 μmol/L的血管緊張素Ⅱ進(jìn)行處理）、白藜蘆醇梯度組（加入10、30、100 μmol/L白藜蘆醇進(jìn)行處理）、聯(lián)合組（加入1 μmol/L的血管緊張素Ⅱ+10、30、100 μmol/L白藜蘆醇進(jìn)行處理）及對(duì)照組（不做特殊處理），分別于反應(yīng)0、6、12、24 h時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。VSMCs在培養(yǎng)完成后加DMEM培養(yǎng)液同步化24 h，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組給予不同的處理措施，并采用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別在對(duì)應(yīng)時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，重復(fù)試驗(yàn)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞活力檢測(cè)采用MTT法，按照每孔1×103個(gè)細(xì)胞接種在96孔板上，采用培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h并同步化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組不同給予不同的處理措施，之后在不同時(shí)間點(diǎn)采用MTT法檢驗(yàn)細(xì)胞活力，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)量A值，重復(fù)3次，每次6復(fù)孔。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間對(duì)比采用單因素方差分析，兩兩對(duì)比采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1白藜蘆醇對(duì)VSMCs細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

從各組的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果來看，總體結(jié)果為血管緊張素組>聯(lián)合組>白藜蘆醇梯度組>對(duì)照組，其中血管緊張素組VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯著高于對(duì)照組；培養(yǎng)24 h 時(shí)，白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)最低（P<0.05）；聯(lián)合組中30 、100 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）（表1）。

2.2白藜蘆醇對(duì)VSMCs細(xì)胞活力的影響

從各組細(xì)胞活力情況來看，總體結(jié)果為血管緊張素組>聯(lián)合組>白藜蘆醇梯度組>對(duì)照組，其中血管緊張素組VSMCs的細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯著高于對(duì)照組；培養(yǎng)24 h時(shí)，同樣白藜蘆醇梯度組中30 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)最高（P<0.05）；聯(lián)合組中30、100 μmol/L濃度下細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著低于10 μmol/L（P<0.05）（表2）。

3討論

動(dòng)脈粥樣硬化是由于動(dòng)脈壁內(nèi)膜的一系列細(xì)胞改變的最終結(jié)果，同時(shí)也是引發(fā)多種心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，近年來的發(fā)生率逐漸上升，嚴(yán)重危害患者健康[5-6]。有流行病學(xué)調(diào)查顯示，長(zhǎng)期適量飲用葡萄酒的人群心血管疾病的發(fā)生率和死亡率均相對(duì)低于其他人群[7]，這一調(diào)查表明葡萄酒中的某些成分可能能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展。進(jìn)一步的研究顯示，葡萄酒中含量較高的白藜蘆醇具有多種藥理學(xué)作用，包括抗炎、抗血小板、保護(hù)心血管等[8-10]，可能是抑制動(dòng)脈粥樣硬化的重要原因。

主動(dòng)脈VSMCs的增殖是冠狀動(dòng)脈硬化的基礎(chǔ)，同時(shí)也是誘發(fā)高血壓、冠心病及介入術(shù)后再狹窄等疾病的主要原因[11-13]。血管緊張素Ⅱ是一種重要的血管活性物質(zhì)，能夠特異性地誘導(dǎo)VSMCs的增殖。近年來的研究顯示，抑制血管緊張素Ⅱ?qū)е碌腣SMCs增殖可有效防止心血管疾病的進(jìn)一步發(fā)展[14]。目前白藜蘆醇用于動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用已有報(bào)道，但關(guān)于白藜蘆醇對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下的VSMCs增殖作用國(guó)內(nèi)報(bào)道尚少。白藜蘆醇的心血管保護(hù)作用機(jī)制涉及抑制血小板聚集和組織因子的表達(dá)、促進(jìn)血管舒張、抑制脂質(zhì)過氧化、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖等。在關(guān)于白藜蘆醇與PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)性的一項(xiàng)研究中顯示，白藜蘆醇預(yù)處理后，心肌組織中Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2下調(diào)，心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)量顯著下降[15]。同時(shí)應(yīng)用白藜蘆醇和渥曼青霉素時(shí)，白藜蘆醇的上述作用顯著減弱，這一結(jié)果提示白藜蘆醇減少心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax/Bcl-2來實(shí)現(xiàn)的，且有PI3K-Akt信號(hào)通路的參與。此外，NO還可以通過影響缺血再灌注過程中的炎癥反應(yīng)過程，減少心肌細(xì)胞壞死和凋亡，而白藜蘆醇能夠提高心肌組織中的NO含量及活性。本次研究中通過體外實(shí)驗(yàn)來評(píng)估白藜蘆醇對(duì)VSMCs的抑制作用，并評(píng)價(jià)了其對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下的VSMCs增殖的抑制效果。從研究數(shù)據(jù)來看，血管緊張素組的VSMCs細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，說明血管緊張素可顯著地增加VSMCs細(xì)胞的增殖能力。從白藜蘆醇的抑制作用來看，10 μmol/L濃度下的白藜蘆醇并不能有效抑制VSMCs的增殖，而30、100 μmol/L濃度下VSMCs細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活力均得到有效抑制，說明白藜蘆醇具有濃度依賴性的特點(diǎn)。從血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下的VSMCs增殖抑制情況來看，基本與常規(guī)抑制結(jié)果相近，同樣在30、100 μmol/L濃度下能夠有效控制VSMCs的增殖。說明白藜蘆醇可有效抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)下的VSMCs增殖，分析原因可能與白藜蘆醇的抗氧化作用有關(guān)。但由于研究時(shí)間等因素所限，本次研究中未能闡明其作用機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

綜上所述，白藜蘆醇對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞增殖有著一定的作用，且對(duì)于血管緊張素Ⅱ所誘導(dǎo)的增殖有著較強(qiáng)的抑制效果，不同濃度下作用效果有所差異。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Little PJ，Getachew R，Rezaei HB，et al.Genistein inhibits PDGF stimulated proteoglycan synthesis in vascular smooth muscle without blocking PDGF beta receptor phosphorylation[J].Arch Biochem Biophys，2012，525（1）：25-31.

[2]Badimon L，Vilahur G.LDL-cholesterol versus HDL-cholesterol in the atherosclerotic plaque：inflammatory resolution versus thrombotic chaos[J].Ann N Y Acad Sci，2012，1254（2）：18-32.

[3]Chu LM，Lassaletta AD，Robich MP，et al.Resveratrol in the prevention and treatment of coronary artery disease[J].Curr Atheroscler Rep，2011，13（6）：439-446.

[4]Paffett ML，Lucas SN，Campen MJ.Resveratrol reverses monocrotaline-induced pulmonary vascular and cardiac dysfunction：a potential role for atrogin-1 in smooth muscle[J].Vascul Pharmacol，2012，56（1-2）：64-73.

[5]郜攀，司良毅，徐強(qiáng)，等.白藜蘆醇對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用及其機(jī)制觀察[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38（4）：269-273.

[6]李亮，許彥芳.AngⅡ?qū)π募〖?xì)胞Kv4.2鉀通道蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制[J].武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，19（1）：26-28.

[7]Putnam K，Shoemaker R，Yiannikouris F，et al.The reninangiotensin system：a target of and contributor to dyslipidemias，altered glucose homeostasis，and hypertension of the metabolic syndrome[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2012，302（6）：H1219-H1230.

[8]Guo RW，Wang H，Gao P，et al.An essential role for stromal interaction molecule 1 in neointima formation following arterial injury[J].Cardiovasc Res，2009，81（4）：660-668.

[9]李春燕，江山，岳渝娟，等.分化抑制因子1對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響及其途徑[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（6）：569-572.

[10]馮帆，高旭東，陸蔭英，等.LINE-1 ORF-1p對(duì)肝臟腫瘤細(xì)胞系和肝源永生化細(xì)胞系增殖的調(diào)控作用[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012，37（3）：213-216.

[11]賈慶華，楊霄鵬，惠玲，等.醋酸鉛對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞凋亡及Caspase-3表達(dá)的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2012， 37（6）：628-631.

[12]Campbell KA，Lipinski MJ，Doran AC，et al.Lymphocytes and the adventitial immune response in atherosclerosis[J].Circ Res，2012，110（6）：889-900.

[13]Kroon PA，Iyer A，Chunduri P，et al.The cardiovascular nutrapharmacology of resveratrol：pharmacokinetics，molecular mechanisms and therapeutic potential[J].Curr Med Chem，2010，17（23）：2442-2455.

[14]王智敏，吳瑕.阿托伐他汀對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠左心室肥厚的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2012，47（4）：554-556.

[15]Schreiner CE，Kumerz M，Gesslbauer J，et al.Resveratrol blocks Akt activation in angiotensin Ⅱ-or EGF-stimulated vascular smooth muscle cells in a redox-independent manner[J].Cardiovasc Res，2011，90（1）：140-147.

（收稿日期：2016-12-01 本文編輯：方菊花）