芹菜素誘導膀胱癌5637細胞凋亡研究

謝楊春+鄧永誠+田黎

【摘 要】 目的：研究芹菜素對人膀胱癌5637細胞增殖及凋亡的影響。方法：采用20～80μmol/L 芹菜素處理5637細胞，MTT法檢測膀胱癌5637細胞增殖抑制率；細胞軟瓊脂克隆形成實驗檢測細胞成瘤能力的抑制效率；Hoechst 33258細胞核染色法觀察細胞凋亡的形態學改變。結果：芹菜素呈濃度依賴的抑制5637細胞的增殖；80μmol/L芹菜素處理組細胞出現核固縮、染色質凝集和核碎片化等典型的細胞凋亡特征；5637細胞的克隆形成能力隨著芹菜素濃度增加而顯著降低。結論：芹菜素能夠抑制人膀胱癌5637細胞的增殖，抑制5637的克隆形成，并誘導細胞凋亡。

【關鍵詞】 芹菜素；膀胱癌；細胞增殖；細胞凋亡

【中圖分類號】R285.5 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）12-0047-03

Abstract：Objective To study the effects of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， the MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. Apoptosis of 5637 cells was observed under a fluorescence microscope using Hoechst 33258 staining， 5637 tumorigenicity was messaured by soft colony formation assay. Results Apigenin causes concentration-dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. 5637 cells treated with apigenin showed significant morphological changes of apoptosis， and the cell tumorigenicity was inhibited as apigenin concentration increased. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells.

Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Proliferation； Apoptosis

膀胱癌是最常見的泌尿系統腫瘤，其中移行細胞癌（Transitional Cell Carcinoma，TCC）占90%，又稱為尿路上皮癌，其中70%～85%的移行細胞癌為表淺性膀胱癌[1]。臨床中非肌層浸潤性膀胱癌的常用治療方法為經尿道膀胱腫瘤切除術[2]。然而，經尿道膀胱腫瘤切除術后的患者有50%～80%的復發，10%～25%的患者復發后發展為肌層浸潤性膀胱癌[3]。為了抑制膀胱腫瘤的復發及進一步惡化，化療以及免疫治療被廣泛用于淺表性膀胱癌患者的術后治療中。較常用的膀胱內化療及免疫治療的藥物包括順鉑、絲裂霉素 C、卡介苗以及干擾素-α[4-5]。這些方法雖然在一定程度上取得療效，但是通常給患者帶來不可逆轉的系統毒性以及嚴重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[6]。因此，尋求無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物十分迫切。

芹菜素（5，7，4′-三羥基黃酮，Apigenin， API），又稱芹黃素，是一種廣泛存在于多種水果和蔬菜中的黃酮類化合物，具有多方面的藥理作用[7-8]，以抗腫瘤作用最為突出。實驗證明芹菜素在體外能夠顯著抑制多種類型的癌細胞的生長和誘導其凋亡，包括：宮頸癌[9]、卵巢癌[10]、結腸癌[11]、胃癌[12]等，而在膀胱癌中的作用研究鮮有報道。本實驗觀察了芹菜素對人膀胱癌5637細胞的生長抑制以及誘導凋亡作用。

1 材料與細胞

1.1 試劑 芹菜素（質量分數≥98%，批號：22806）購自阿拉丁公司；MTT，低熔點瓊脂糖、二甲基亞砜（DMSO），蛋白酶抑制劑購自Sigma；Hoechst 33258，購置南京碧云天。RPMI 1640培養基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均購自GIBCO公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 細胞株及細胞培養 人膀胱癌細胞株5637購自中國科學院上海細胞庫；培養于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養液中，于37 ℃、5% CO2、95% O2細胞培養箱內常規傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測芹菜素對膀胱癌細胞5637增殖的影響 將5637細胞以3×103/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后分別加入不同濃度的芹菜素（20、40、80μmol/L），每孔100μl，每個濃度設4個復孔，同時以不加芹菜素為空白對照組培養72h 后，向每孔中加入5.0g/L的MTT 20μl繼續培養4h，棄上清，向每孔中加入DMSO 200μl溶解結晶體，置于搖床振蕩30min，至藍紫色顆粒完全溶解后，于酶標儀490nm波長處測定每孔吸光度值（A），并計算細胞增殖率（%）=（藥物處理孔A值-空白孔A值）/（對照孔A值-空白孔A值）×100%。實驗重復3次，計算平均值。

2.2 Hoechst 33258 細胞核染色法觀察細胞凋亡的形態學改變 將5637細胞以2×105/孔接種于6孔板中，80μmol/L芹菜素（以不加芹菜素為空白對照組）作用24h后，吸去培養液，用PBS清洗2次，迅即加入4%的多聚甲醛液固定10min后，吸去固定液，以PBS清洗1次，加入5.0mg/L的Hoechst 33258，染色10min，用PBS 清洗3次后，在Zeiss Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡下以340nm 激發光觀察細胞凋亡形態并隨機拍照。

2.3 軟瓊脂克隆形成實驗檢測芹菜素對5637克隆形成能力的影響 將1×103個5637細胞懸浮液1ml RPMI 1640 （0.3%低熔點瓊脂糖，10%FBS， 1%雙抗）并加入不同濃度的芹菜素（40、80μmol/L），接種于預處理的6孔板中，同時以不加芹菜素為空白對照組。6孔板預先放入1ml RPMI 1640 （0.6%低熔點瓊脂糖， 10%FBS， 1%雙抗）。培養3周以后，細胞克隆形成，采用0.01%結晶紫染色，觀察計數。實驗重復3次。

2.4 統計學分析 采用SPSS 11.0統計軟件進行數據處理，實驗數據均以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P< 0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 芹菜素對5637細胞增殖的抑制作用 不同濃度芹菜素處理的細胞的增殖均受到不同程度的抑制，與空白對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。芹菜素對5637細胞增殖的抑制作用呈一定的濃度依賴性，采用不同濃度（20、40、60、80μmol/L）處理后，隨著濃度的增加，其抑制效果更明顯。見圖1。

3.2 芹菜素對5637細胞克隆形成能力的抑制作用 不同濃度芹菜素處理的細胞克隆形成能力均受到嚴重的抑制，與空白對照組相比差異有統計學意義（P<0.05）。芹菜素對5637細胞的克隆形成能力的抑制作用呈一定的濃度依賴性，采用不同濃度（40、80μmol/L）芹菜素處理后，隨著濃度的增加，其抑制效果更明顯。見圖2。（圖2左圖為芹菜素對5637細胞克隆形成抑制作用的觀察；右圖為芹菜素對5637細胞克隆形成抑制作用的統計學分析。）

3.3 芹菜素誘導5637細胞凋亡的形態學變化 采用Hoechst 33258染色的細胞核結果顯示，80μmol/L芹菜素處理后，大量的5637細胞出現核固縮、染色質凝集和核碎片化等典型的細胞凋亡特征；與此相比，對照組的活細胞，細胞核膜完整，核呈圓形或橢圓形，染色質分布較均勻，細胞核為藍色均勻淡染，并未見凋亡細胞（圖3左圖為芹菜素對5637細胞凋亡誘導的細胞核形態觀察；右圖為芹菜素對5637細胞凋亡誘導的統計學分析）。以上實驗結果表明芹菜素可誘導5637細胞凋亡。

4 討論

芹菜素作為一種廣泛存在于植物中的天然黃酮類化合物，近年來已成為研究的熱點[13]，但有關芹菜素抗膀胱癌作用的實驗研究比較少。逃逸了正常細胞增殖的調控體系而自主地無限生長是腫瘤細胞的典型特征。通過MTT實驗實驗結果顯示，20、40、60、80μmol/L芹菜素對人膀胱癌5637細胞的增殖能力具有顯著的抑制的作用，且隨著濃度的增加抑制效果更加明顯，呈現出良好的和量效關系。芹菜素抑制膀胱癌細胞增值的主要機制，可能與其直接抑制5637細胞生長，并誘導5637細胞凋亡等有關。

在有機體中，細胞凋亡是一個復雜的生理和病理過程，腫瘤的增值與凋亡是調控腫瘤的發生、發展的最重要的因素之一。研究腫瘤的發生發展機制，尋找抑制腫瘤細胞增值，增加腫瘤細胞凋亡的分子藥物，是抑制腫瘤生長，阻礙腫瘤發生、發展的一個重要途徑。我們通過Hoechst 33258細胞核染色結果顯示，80μmol/L芹菜素處理人膀胱癌5637細胞，大部分細胞細胞出現核固縮、染色質凝集和核碎片化等典型的細胞凋亡特征。腫瘤的自我更新能力是腫瘤細胞一個重要特征，我們采用軟瓊脂克隆形成實驗檢測芹菜素對膀胱癌5637細胞自我更新能力的影響[14]，結果顯示，40、80μmol/L芹菜素對人膀胱癌5637細胞的克隆形成能力具有顯著的抑制的作用，且隨著濃度的增加抑制效果更加明顯，呈現出良好的和量效關系。

總之，我們的研究發現芹菜素作為一種植物提取的活性成分，能夠抑制人膀胱癌5637細胞的增殖以及克隆形成，并誘導其凋亡，芹菜素有望成為無毒副作用且有效的膀胱癌治療藥物。

參考文獻

[1] Torre L. A.，Bray F.，Siegel R. L.，et al. Global cancer statistics， 2012[J]. CA Cancer J Clin，2015， 65（2）：87-108.

[2] Kang M.R.，Yang， G.，Place R. F.，et al. Intravesical delivery of small activating RNA formulated into lipid nanoparticles inhibits orthotopic bladder tumor growth[J]. Cancer Res，2012， 72（19）：5069-5079.

[3]Richards K. A.，Smith N. D.，Steinberg G. D. The importance of transurethral resection of bladder tumor in the management of nonmuscle invasive bladder cancer： a systematic review of novel technologies[J].J Urol，2014， 191（6）：1655-1664.

[4] Griffin J. G.，Holzbeierlein J. Side effects of perioperative intravesical treatment and treatment strategies for these side effects[J].Urol Clin North Am，2013， 40（2）：197-210.

[5] Logan C.，Brown M.， Hayne D. Intravesical therapies for bladder cancer - indications and limitations[J]. BJU Int，2012， 110（Suppl 4）：12-21.

[6] Singh C. K.，George J.，Ahmad N. Resveratrol-based combinatorial strategies for cancer management[J].Ann N Y Acad Sci，2013， 1290：113-121.

[7] Bao Y. Y.，Zhou S. H.，Fan J.，et al. Anticancer mechanism of apigenin and the implications of GLUT-1 expression in head and neck cancers[J]. Future Oncol，2013， 9（9）：1353-1364.

[8] Venigalla M.， Gyengesi E.，Munch G. Curcumin and Apigenin-novel and promising therapeutics against chronic neuroinflammation in Alzheimer′s disease[J]. Neural Regen Res，2015， 10（8）：1181-1185.

[9] Zheng P. W.，Chiang L. C.，Lin C. C. Apigenin induced apoptosis through p53-dependent pathway in human cervical carcinoma cells[J]. Life Sci，2005， 76（12）：1367-1379.

[10] Suh Y. A.， Jo S. Y.， Lee H. Y.， et al. Inhibition of IL-6/STAT3 axis and targeting Axl and Tyro3 receptor tyrosine kinases by apigenin circumvent taxol resistance in ovarian cancer cells[J]. Int J Oncol，2015， 46（3）：1405-1411.

[11] Lee Y.， Sung B.， Kang Y. J.， et al. Apigenin-induced apoptosis is enhanced by inhibition of autophagy formation in HCT116 human colon cancer cells[J]. Int J Oncol，2014， 44（5）：1599-606.

[12] Kuo C. H.， Weng B. C.， Wu C. C.， et al. Apigenin has anti-atrophic gastritis and anti-gastric cancer progression effects in Helicobacter pylori-infected Mongolian gerbils[J]. J Ethnopharmacol，2014， 151（3）：1031-1039.

[13] Lim W.， Park S.，Bazer F.， et al. Apigenin Reduces Survival of Choriocarcinoma Cells by Inducing Apoptosis via the PI3K/AKT and ERK1/2 MAPK Pathways[J].J Cell Physiol，2016， DOI： 10.1002/jcp.25372

[14] Borowicz S.， Van Scoyk M.， Avasarala S.，et al. The soft agar colony formation assay[J]. J Vis Exp，2014， （92）：e51998.

[15] Naseri M. H.，Mahdavi， M.，Davoodi J.， et al. Up regulation of Bax and down regulation of Bcl2 during 3-NC mediated apoptosis in human cancer cells[J].Cancer Cell Int，2015， 15：55.

[16] Kondo K.，Obitsu S.，Ohta S.，et al. Poly（ADP-ribose） polymerase （PARP）-1-independent apoptosis-inducing factor （AIF） release and cell death are induced by eleostearic acid and blocked by alpha-tocopherol and MEK inhibition[J].J Biol Chem，2010， 285（17）：13079-13091.

（收稿日期：2016.05.09）