三七總皂苷通過影響VEGF的表達改善多柔比星腎病大鼠蛋白尿

帥林 楊頌 余磊

摘要：目的探討三七總皂苷對多柔比星小鼠腎的保護作用及可能的機制。 方法將 24 只 8 周齡雄性 SD 大鼠隨機分為 3 組：正常對照組，模型對照組和治療組。模型對照組和治療組予多柔比星建模，治療組腹腔注射血栓通，連續(xù) 4 周，每周檢測大鼠尿白蛋白 / 尿肌酐比值，4 周后檢測 24h 尿微量白蛋白及各組大鼠腎組織中 VEFG 蛋白的表達情況。 結果 注射多柔比星 1 周后，大鼠尿白蛋白/ 尿肌酐的比值開始升高，3 周和 4 周時，與模型對照組相比，治療組的比值較模型對照組低， 差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與模型對照組相比，治療組的 24h 尿微量白蛋白低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與對照組相比，模型對照組和治療組的血管內皮生長因子（VFGF）蛋白表達降低，與模型對照組相比，治療組的 VEGF 蛋白表達較高。 結論三七總皂苷具有改善化療藥物多柔比星引起的腎損害，其作用機制可能與增加 VEGF 蛋白的表達有關。

關鍵詞：三七總皂苷;蛋白尿;血管內皮生長因子（VFGF）

【中圖分類號】R322.6 【文獻標識碼】A 【文章編號】2107-2306（2019）05-017-02

大量蛋白尿是腎病綜合征（NS）最主要的表現(xiàn)，也是腎臟疾病最常見的臨床表現(xiàn)之一。多柔比星腎病是實驗性腎損傷的經典模型，其主要表現(xiàn)類似于人類的微小病變型腎病，故國內外學者均用此模型模擬研究腎損傷 [1]。

三七總皂苷（panax notoginseng saponins， PNS）是從多年生草本植物中藥三七中提取的有效成分，毒副作用小， 應用于很多疾病，具有活血、補血、溶血及抗溶血、抗炎、降脂、降血糖、抗衰老及抗氧化等作用 [2]。有研究表明三七總皂苷能提高血漿白蛋白，增加尿量，改善患者血液高凝狀態(tài)[3]，并能抑制血小板活化[4]，從而減少微量蛋白尿，且未發(fā)現(xiàn)明顯副作用 [5]。

多柔比星是臨床常用的化療藥物之一，本研究通過建立多柔比星腎病模型，觀察三七總皂苷對化療后腎性蛋白尿的影響，觀察尿白蛋白 / 尿肌酐比值，并從三七總皂苷對 VEGF 蛋白表達的影響，探討三七總皂苷改善化療后腎組織損傷的機制。

實驗用動物為SPF級雄性SD（Sprague-Dawley） ?大鼠24只，體質量 200-250g。血栓通粉針 （ 主要成分為三七總皂苷，PNS）&nbsp;，麗珠集團利民制藥廠生產，批號：Z44020284。多柔比星， 輝瑞制藥有限公司， 批號： H20100406。

2.1?分組與給藥 8?周齡雄性 SD?大鼠 24 只，適應性喂養(yǎng)1 周，隨機分為 3 組，每組 8 只，分別為：正常對照組， 模型對照組和治療組。模型對照組和治療組大鼠尾靜脈一次性注射多柔比星5.5mg/kg，繼續(xù)飼養(yǎng)1周。1周后開始藥物干預，治療組腹腔注射血栓通粉針7.5mg/kg·d （ 相當于成人用量 ），對照組予腹腔灌注等量5%葡萄糖水，連續(xù)4周。

2.2?標本采集與檢測 分別于每周用代謝籠收集清晨隨機一次尿液，離心（3500r/min，15min），取上清液，置 -80℃ 冰箱保存?zhèn)溆茫郎y尿微量白蛋白、尿肌酐，采用全自動生化分析儀檢測。4?周末，留取 24h?尿液，離心取上清， 采用全自動生化分析儀檢測尿微量白蛋白。4?周末，取腎臟皮質組織標本，提取總蛋白，待測腎組織 VEGF?的水平， 采用免疫蛋白印跡法檢測。

蛋白質印跡法檢測 采用含蛋白酶抑制劑的組織裂解液[1g/L?十二烷基磺酸鈉（SDS）、10g/L脫氧膽酸鈉（Sodium Deoxycholate） 、 10mL/L Triton X-100 、 150mmol/L 氯化鈉（NaCl）、10mmol/L?乙二胺四乙酸 （EDTA）、25mmol/L?Tris HCl（pH?7.2）、1mmol/L?苯甲基磺酰氟 （PMSF）、1?mg/L?抑

肽 酶 （aprotinin） 、 1mg/L 亮 抑 肽 酶 （leupeptin） 、 1mg/L?胃蛋白酶抑制劑 （pepstatin）]?于超聲粉碎儀冰上裂解腎組織 ，

13000r/min?低溫離心 15min 取上清即為總蛋白 ; 每孔 75g?總蛋白進行 80g/L?十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDSPAGE）， 濕轉法轉移至硝酸纖維素膜 ;50g/L 脫脂奶室溫封閉1h;?分別加封閉液稀釋的小鼠抗人 VEGF1-140?氨基端的單克隆抗體 C1?和小鼠抗兔 GAPDH?單克隆抗體于 4℃過夜 ; 然后加辣根過氧化物酶 （HRP）?標記的羊抗鼠 IgG?室溫反應1h; 電化學發(fā)光法 （ECL） 發(fā)光試劑反應 1min; 曝光。

統(tǒng)計學處理 采用 SPSS16.0?軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用重復測量的方差分析，組間比較采用兩兩比較的 t?檢驗， 組間差異分析采用 One-way?ANOVA?分析。P?< 0.05?為差異有統(tǒng)計學意義。

三七總皂苷對各組大鼠尿白蛋白 /?尿肌酐的影響注射多柔比星 1?周后，大鼠尿白蛋白 /?尿肌酐的比值升高，2 周后比值大幅度升高，4 周時達到實驗觀察的最高值，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。1 周和 2 周時，模型對照組和治療組的尿白蛋白 / 尿肌酐的比值無明顯統(tǒng)計學差異，3 周和 4 周時，與模型對照組相比，治療組的尿白蛋白 / 尿肌酐的比值更低，差異有統(tǒng)計學意義（P< 0.05）。見表 1 和圖 1。

3.2?三七總皂苷對各組大鼠蛋白尿的影響 給與 SD?大鼠

分別處理 4?周后，留取 24h?尿液進行尿微量白蛋白的檢測， 結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型對照組和治療組的 24h?尿微量白蛋白明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P?< 0.05）， 與模型對照組相比，治療組的 24h?尿微量白蛋白更低，差異有統(tǒng)計學意義（P?< 0.05）。見圖 2。

3.3?三七總皂苷對各組大鼠腎組織中 VEFG 蛋白表達的影響 在各組大鼠的腎組織中檢測 VEGF 蛋白，結果發(fā)現(xiàn)， 與對照組相比，模型對照組和治療組的 VEGF?蛋白表達明顯降低，與模型對照組相比，治療組的VEGF?蛋白表達較高。見圖 3。

三七總皂苷是中草藥三七的主要生理活性成分，目前臨床廣泛應用的血栓通制劑的主要成分，具有抗缺氧、衰老、耐缺氧以及提高人體免疫力等作用，在人體各個系統(tǒng)及物質代謝方面都具有明顯優(yōu)勢。最近的研究顯示，黃芪聯(lián)合三七能有效減輕糖尿病大鼠的尿蛋白，減輕足細胞的損傷， 主要機制是減輕足細胞足突融合，改善足細胞裂孔隔膜蛋白nephrin?表達，保護腎臟[6]。本研究擬用經典的多柔比星腎病大鼠作為實驗對象，探討化療后腹腔灌注三七總皂苷對腎臟的保護作用。結果顯示，注射多柔比星 1?周后，大鼠尿白蛋白/ 尿肌酐的比值升高，2 周后比值大幅度升高，

4 周時達到實驗觀察的最高值，差異有統(tǒng)計學意義。1?周和2 周時，模型對照組和治療組的尿白蛋白/ 尿肌酐的比值無明顯統(tǒng)計學差異，3 周和 4 周時，與模型對照組相比，治療組的尿白蛋白/ 尿肌酐的比值更低，差異有統(tǒng)計學意義。且能夠減少蛋白尿，表明三七總皂苷具有一定的改善腎功能的作用，減少蛋白尿的發(fā)生。

VEGF?是由多肽鏈通過二硫鍵連接構成的同源二聚體糖蛋白，屬于血小板衍生生長因子家族，也是內皮細胞特異性絲裂原 [7] 。在心、腎、肺等臟器組織都有表達 [8]，在腎小球足細胞、遠端腎小管和集合管處高表達，主要作用是維持腎小球濾過障的完整性和足細胞活性 [9]。VEGF?受體主要表達于腎小球內皮細胞、間質細胞以及管旁毛細血管，VEGF?及受體結合后，能夠促進內皮細胞增殖和遷移、抑制內皮細胞凋亡、提高毛細血管通透性、改變細胞外基質、促進血管增生以及維持血管功能等作用[10]。蛋白尿和抑制 VEGF?的表達成正相關關系，抑制 VEGF?通路，能夠降低足細胞裂孔隔膜蛋白 nephrin?的表達，增加足細胞足突融合 ， 甚至導致腎病綜合征和 /?或腎小球血栓性微血管病變等腎臟疾病的發(fā)生 [10]。本研究在各組大鼠的腎組織中檢測 VEGF?蛋白，結果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型對照組和治療組的 VEGF?蛋白表達明顯降低，與模型對照組相比， 治療組的 VEGF?蛋白表達升高，提示化療藥物可以通過抑制 VEGF?通路導致大鼠腎臟功能受損，三七總皂苷可通過增加 VEGF 的表達保護腎臟功能。

本研究結果分析，多柔比星能夠通過抑制 VEGF 通路導致大鼠蛋白尿的發(fā)生，損傷大鼠腎功能。三七總皂苷可以逆轉多柔比星對 VEGF 通路的抑制，增加 VEGF 蛋白的表達，從而使腎血管舒張，改善腎臟微循環(huán)，減輕腎小球損害，這可能是三七總皂苷減少尿蛋白形成，保護腎功能的機制之一，為血栓通應用與臨床化療后保護患者的腎功能提供了理論依據(jù)。但具體的調節(jié)機制有待進一步研究。

[1] Li J S， Chen X， Peng L， et al. Angiopoietin-Like-4， a Potential?Target?of?Tacrolimus，?Predicts?Earlier?Podocyte?Injury?in Minimal Change Disease[J]. Plos One， 2015， 10（9）： e0137049.

[8]?張彬 ， 保莉 ， ?張霞 ， et?al.??糖尿病腎病患者血清

VEGF 與微量白蛋白尿的相關性研究 [J]. 寧夏醫(yī)學雜志 ， 2016， 38（3）： 196-198.

[基金項目]2019 年度泰州市人民醫(yī)院院級科研基金（ZL201917）

[作者簡介]帥林（1986-），男，漢族，江蘇泰州人，醫(yī)師

[通信作者]余磊E-mail：guying500@163.com