大鼠抗人β-catenin多克隆抗體的制備與鑒定①

牛夏憶 李 淼 張 倩 陳云雨 劉曉平

(皖南醫(yī)學(xué)院藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，蕪湖241002)

Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常活化在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、急慢性淋巴細(xì)胞白血病、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，已成為腫瘤靶向治療的重要靶標(biāo)之一[1,2]。β-catenin是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)分子，其核心功能區(qū)包括犰狳蛋白重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域(138-686 aa)蛋白和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(687-781 aa)，主要介導(dǎo)與Wnt信號(hào)通路其他蛋白相互作用和染色質(zhì)重塑復(fù)合體的募集[3]。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，β-catenin通過與Tcf4(T-cell factor 4)和Lef1(lymphoid enhancer factor 1)相互作用而啟動(dòng)大量原癌基因表達(dá)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長、分化、增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移[4,5]。另外，Spranger等研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)β-catenin可能是黑色素瘤抵抗免疫治療的重要機(jī)制之一，但β-catenin如何在腫瘤微環(huán)境中調(diào)控免疫耐受的分子機(jī)制尚未明確[6,7]。

本實(shí)驗(yàn)旨在利用DNA重組技術(shù)進(jìn)行人β-catenin(138-781 aa)原核表達(dá)與分離純化，并以此為抗原制備特異性大鼠多克隆抗體(Polyclonal antibody,PcAb)，為深入研究β-catenin在腫瘤免疫耐受中的分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 GST-β-catenin-pGEX-4T-1重組質(zhì)粒和pET-30a(+)載體由中國科學(xué)院大學(xué)存濟(jì)醫(yī)學(xué)院袁莉教授惠贈(zèng)；E.coliDH5α及E.coliRosetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞、Taq酶、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量、pEASY?-T1試劑盒、T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量、BamHⅠ與XhoⅠ購自全式金公司；二辛可寧酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自Thermo公司；氨芐西林、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)購自阿拉丁公司；牛血清白蛋白、小鼠抗組氨酸(Histidine,His)標(biāo)簽單抗、辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和HRP-山羊抗大鼠IgG購自Biosharp公司；……